Diese Arbeit wurde unterstützt von den National Institutes of Health (R37CA228304 und R01HL146642 bis Xi Chen, CA148761 an Jeffrey M. Rosen), dem US Department of Defense (W81XWH-19-1-0524 an Xi Chen, W81XWH-19-1-0035 an Xiangdong Lv), der American Cancer Society (RSG-18-181-01-TBE an Xi Chen) und dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR150009 CPRIT Scholar in Cancer Research Award an Xi Chen), der Patient-Derived Xenograft and Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine (Finanzierung durch RP170691 CPRIT Core Facility Award und NCI-CA125123 P30 Cancer Center Support Grant).

Alle Protokolle, in denen Tiere verwendet werden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) überprüft und genehmigt. Die Tumorfragmente, etwa 1-2 mm3 groß, stammen aus lebensgefrorenen Beständen, die aus dem patientenabgeleiteten Xenograft und Advanced In Vivo Models Core am Baylor College of Medicine gewonnen wurden.
1. Herstellung von kryokonservierten Brusttumorfragmenten für die Transplantation
<ol><li>Übertragen Sie das Kryovial mit Tumorfragmenten von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C wasserhaltiges Bad.</li>
	<li>Rühren Sie das Kryovial mit einem gelegentlichen sanften Schlag während des Auftauens.</li>
	<li>Nachdem das Gewebe aufgetaut ist, nehmen Sie das Kryovial aus dem Wasserbad und mischen Sie es durch sanfte Inversion.</li>
	<li>Trocknen Sie die Außenseite des Kryovials ab und sprühen Sie es mit 70% Ethanol. Übertragen Sie es auf eine Biosicherheitshaube.</li>
	<li>Übertragen Sie das aufgetaute Tumorgewebe in ein 15-ml-konisches Röhrchen, das mit 10 ml kaltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gefüllt ist. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie das Rohr umkehren. Lassen Sie die Gewebefragmente sich am Boden der Röhre absetzen.</li>
	<li>Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie in 10 ml kaltem DMEM. Legen Sie die Röhre auf Eis. HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation.</li>
</ol>2. Sammlung und Vorbereitung von frischem Brusttumor für die Transplantation
<ol><li>Euthanisieren Sie die Brusttumor tragende Maus. HINWEIS: PDX-Wirt können SCID/Beige-, NSG- oder NRG-weibliche Mäuse sein, während in der aktuellen Studie weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 3-5 Wochen verwendet werden.</li>
	<li>Besprühen Sie die Tumorregion der eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol. HINWEIS: Versuchen Sie, Haare mit der Tumorprobe zu vermeiden, die eine Kontamination von Tumorfragmenten für Kryolager oder Transplantation verursachen könnten.</li>
	<li>Mit gezackten Zinnen, um die Haut, die den Tumor umgibt, zu kneifen und anzuheben, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen Schnitt zu machen.</li>
	<li>Trennen Sie den Tumor mit der Schere von der Haut, um den gesamten Tumor von der Wirtsmaus zu sezieren. Schneiden Sie das verbleibende Mausfettpolstergewebe von der äußeren Oberfläche des Tumors ab. Legen Sie den Tumor in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit 5 ml kaltem DMEM gefüllt ist. HINWEIS: Verwenden Sie Tumore mit einer maximalen Größe von 1 cm Durchmesser, da größere Tumore wahrscheinlich nekrotische Kerne enthalten.</li>
	<li>In einer Biosicherheitshaube den sezierten Tumor in eine sterile 10 cm Petrischale geben, die genügend DMEM enthält, um ein Austrocknen zu verhindern.</li>
	<li>Schneiden Sie den Tumor in 1 mm3 Fragmente mit Skalpell oder Klinge unter aseptischen Bedingungen. HINWEIS: Das Skalpell oder die Klinge sollte vor Gebrauch mindestens 20 Minuten lang in der Biosicherheitshaube unter UV-Strahlen ausgesetzt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Tumorfragmente in ein 15 ml konisches Röhrchen, das mit kaltem DMEM gefüllt ist. Legen Sie die Röhre auf Eis. HINWEIS: Das Gewebe ist bereit für die Transplantation. Die sezierten Tumorfragmente aus Schritt 2.4 können 1) in flüssigem Stickstoff für die Protein- und RNA/DNA-Extraktion eingefroren, 2) mit 4% Paraformaldehyd (PFA) oder 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) für hämatoxylin und Eosin (H&E) und immunhistochemische (IHC) Analyse fixiert oder 3) in 1,25 mL Gefriermedium (10% Dimethylsulfoxid [DMSO] kryokonserviert werden, 40% DMEM und 50% fetales Rinderserum [FBS]) durch langsames Einfrieren in einem -80 °C Gefrierfach über Nacht und anschließender Übertragung auf flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung.</li>
</ol>3. Tier auf die Operation vorbereiten
<ol><li>Zur Schmerzbehandlung bei Tieren, subkutan Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung 60 Minuten vor der Operation in einer Dosis von 1 mg / kg injizieren oder befolgen Sie den Leitfaden der Institution für 72 Stunden Analgetikum.</li>
	<li>Richten Sie den Operationssaal nach institutionellen Richtlinien für aseptische Operationen ein.</li>
	<li>Betäuben Sie eine 4 Wochen alte Frau in einer Induktionskammer des Isofluran-Anästhesiegeräts mit einer Geschwindigkeit von ~ 11,25 ml / h. Übertragen Sie die Maus in den Eingriffsbereich, auf die sterile (Silikonkautschuk) Operationsplatte, wo sie durch eine kleine Gesichtsmaske betäubt wird. Legen Sie die Maus auf den Rücken und kleben Sie die Beine in ihren natürlichen Positionen ab. HINWEIS: SCID/Beige, NSG oder NRG werden für PDX und Balb/c für GEMM-Transplantationsmodelle verwendet.</li>
	<li>Tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.</li>
	<li>Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen. HINWEIS: Keine Reaktion/Bewegung des Tieres deutet darauf hin, dass das Tier ausreichend betäubt und bereit für die Operation ist.</li>
	<li>Rasieren Sie die Maus am Unterbauch, insbesondere an der Region um die vierte Brustwarze, in der die Operation stattfinden wird.</li>
	<li>Arbeiten Sie mit einer kreisförmigen Bewegung und beginnen Sie in der Mitte der Operationsstelle mit einem chirurgischen Povidon-Jod-Peeling zu den äußeren Rändern, gefolgt von der Entfernung von Povidon-Jod mit einem 70% igen Isopropyl-Ethanol-Pad. Wiederholen Sie zwei weitere Male.</li>
</ol>4. Transplantation von Tumorfragmenten in das vierte (leistenale) Brustfettpolster
<ol><li>Verwenden Sie einen sterilen chirurgischen Vorhang, um den Körper des Tieres mit Ausnahme der Schnittstelle zu bedecken. HINWEIS: Bestätigen Sie den entsprechenden Sedierungsgrad durch Zehenklemmen, bevor Sie den Schnitt machen.</li>
	<li>Mit gezackter Zette die Haut an der Brustwarze Nr. 4 zusammendrücken und anheben.</li>
	<li>Mit der stumpfen Seite nach unten, verwenden Sie eine Schere, um einen kurzen (ca. 1 cm), parasagittalen Schnitt von der Brustwarze Nr. 4 in Richtung Kopf zu machen.</li>
	<li>Trennen Sie mit einem Applikator mit Baumwollspitze die Haut vom Peritoneum auf der medialen Seite des Schnitts.</li>
	<li>Während Sie die seitliche Seite des Schnitts halten, schälen Sie das Brustfettpolster Nr. 4 vorsichtig mit demselben Tupfer von der Haut.</li>
	<li>Sobald das Fettpolster getrennt ist, fixieren Sie die Haut mit einer 27 G-Nadel in der Nähe des Körpers des Tieres.</li>
	<li>Wenn es experimentell notwendig ist, das Fettpolster des endogenen Maus-Brustepithels zu befreien, führen Sie die folgenden Schritte durch.<ol>
<li>Mit der gezackten Zette das Fettpolster vorsichtig vom Körper wegstrecken und den Leistenlymphknoten lokalisieren, der sich unter den Schnittpunkten der Hauptgefäße in der Drüse befindet (in der Nähe der Stelle, an der die Zette die Drüse hält).</li>
		<li>Kauterisieren Sie vorsichtig die Gefäße medial zum Lymphknoten und das Fett, das das vierte und fünfte Fettpolster bildet, das einen dreieckigen Bereich bildet. HINWEIS: Schalten Sie die Sauerstoffquelle für diesen Schritt vorübergehend aus.</li>
		<li>Schneiden Sie mit einer Mikrodynezierungsschere jedes kauterisierte Gefäß einzeln ab (um sicherzustellen, dass nach jedem Schnitt keine Blutungen auftreten), bis der Abschnitt des Fettpolsters, der den Lymphknoten enthält, entfernt ist.</li>
		<li>Entsorgen Sie das "gereinigte" Fettpolstergewebe.</li>
	</ol></li>
	<li>Halten Sie das vierte Brustfettpolster mit einer stumpfen Trennzette. Mit der anderen Hand die geschlossene Spitze der abgewinkelten Feinzette in die Mitte des Fettpolsters über dem verbleibenden Gefäß und nahe an der Wand des Peritoneums einführen. Öffnen Sie langsam die Zette, um eine kleine Tasche zu machen. Entfernen Sie die abgewinkelte feine Zette aus dem Fettpolster.</li>
	<li>Nehmen Sie mit der abgewinkelten feinen Zette ein Stück Tumorfragment und führen Sie es in die Tasche ein.</li>
	<li>Öffnen Sie langsam die Zettenspitzen, um das Tumorfragment in die Fettpolstertasche freizusetzen.</li>
	<li>Ziehen Sie die abgewinkelte feine Truppe vorsichtig zurück. HINWEIS: Schauen Sie sich die Tasche an, um zu bestätigen, dass das Tumorfragment in der Tasche des Brustfettpolsters verbleibt, wenn Sie die Zette zurückziehen. Tumore können in beide kontralateralen Fettpolster implantiert werden, wenn überschüssiges Tumorgewebe für Experimente oder Banking benötigt wird. Tiere mit doppelseitigen Transplantationen werden wegen bekannter Wechselwirkungen zwischen kontralateralen Tumoren nicht für Behandlungsstudien empfohlen. Alternativ kann ein Trokargerät für den Implantationsprozess verwendet werden.</li>
	<li>Ausgehend von der Basis des Schnitts die Haut auf jeder Seite mit der Klaue und der gezackten Zette sammeln. Bringen Sie die beiden Seiten zusammen und heben Sie sie leicht an, um die Haut auf die Anwendung des Wundclips vorzubereiten. Entkrümmen Sie die Kanten des Einschnitts mit der Klauenzette und kneifen Sie die Kanten zusammen, um oben eine durchgehende Oberfläche zu bilden.</li>
	<li>Halten Sie die beiden Seiten mit einer gezackten Zette zusammen und verwenden Sie den Wundclip-Applikator, um einen Wundclip in der Mitte des Schnitts zu platzieren. Tragen Sie bei Bedarf Gewebekleber an den Enden des Schnitts auf, um sie geschlossen und gesichert zu halten.</li>
	<li>Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig, der sich auf einer wärmenden Oberfläche befindet. Überwachen Sie auf Blutungen, Anzeichen von Dehiszenz und Schmerzen während der postoperativen Phase. Das Tier sollte innerhalb von Minuten nach der Chirurgie aufstehen und sich bewegen.</li>
	<li>Achten Sie mindestens 3 Tage nach der Operation genau auf die Inzisionsstelle und die allgemeine Gesundheit der Tiere. Befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Schmerzbehandlung.</li>
	<li>Reinigen Sie die chirurgischen Werkzeuge für 10 s in einem Glasperlensterilisator, bevor Sie mit der nächsten Transplantation fortfahren. Warten Sie, bis die Werkzeuge vor der Verwendung abgekühlt sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1−4.15, bis alle Mäuse transplantiert sind. HINWEIS: Östrogen-Supplementierung ist für ER+ Tumore erforderlich, die durch Wasser oder langsam freisetzenden Pellets59zugeführt werden können.</li>
</ol>5. Überwachung des Tumorwachstums als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung
HINWEIS: Tastbare Tumoren etablierter transplantierbarer PDXs und p53-Null-Tumoren brauchen zwischen 2 Wochen und 8 Wochen, um sich nach der Operation zu entwickeln, abhängig von den intrinsischen Tumorwachstumsraten.
<ol><li>Messen Sie Tumore in zwei Dimensionen mit Bremssätteln zweimal pro Woche. Berechnen Sie das Volumen mit der Formel: Tumorvolumen (mm3) = B2 x L/2 wobei W die Breite und L die Länge des Tumors ist.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der medikamentösen Behandlung, wenn das Tumorvolumen 150-300 mm3erreicht. HINWEIS: Abhängig von der Eigenschaft der Medikamente kann mundgeschützte oder intraperitoneale Injektion verwendet werden, um die Medikamente zu verabreichen.</li>
	<li>Sammeln Sie Tumorproben und führen SieIHC-Färbung 60,Protein- und RNA / DNA-Isolierung und Immunphänotypisierung61 für verschiedene Zwecke durch. Sammeln Sie Blut und führen Sie eine Immunphänotypisierung durch oder verwenden Sie es für pharmakokinetische / pharmakodynamische Studien.</li>
</ol>

MTL ist Gründer einer Kommanditgesellschaft in StemMed, Ltd. und Gründer und Manager von StemMed Holdings, deren Komplementärin. MTL ist Gründer und Anteilseigner von Tvardi Therapeutics, Inc. LED ist ein entschädigter Mitarbeiter von StemMed, Ltd.

Um Variationen im Tumorwachstum bei Tieren zu reduzieren, ist es wichtig, das Tumorgewebe für die Transplantation in 1 mm3 Fragmente zu schneiden. Modelle, bei denen Weichgewebe wachsen, sind schwieriger zu bearbeiten und die Tumorfragmente müssen etwas größer geschnitten werden (1−2 mm3). Wenn Sie das Gewebe in die Brustfettpolstertasche legen, achten Sie darauf, das Gewebe nicht in mehrere Stücke zu spalten, da dies zu mehreren kleinen Tumoren oder seltsam geformten Tumoren führt.
<p c...

Die meisten Brustkrebstodesfälle können auf wiederkehrende Erkrankungen zurückgeführt werden, die gegen konventionelle Therapien resistent sind1,2. Die Inter- und Intratumorheterogenität von Brustkrebserkrankungen trägt zur Therapieresistenz bei. Darüber hinaus kann tumorheterogenität die genaue Prognose beeinträchtigt und das Krankheitsmanagement herausfordern3,4. Die Identifizierung prädiktiver Biomarker für das Ansprechen wird die klinischen Ergebnisse von Patientinnen mit Brustkrebs signifikant verbessern. Obwohl die meisten Brustkrebsarten immunologisch "kalte" Tumoren sind, die wahrscheinlich nicht auf eine Immuntherapie ansprechen, haben sich Immun-Checkpoint-Inhibitoren in klinischen Studienals vielversprechend erwiesen 2,5. Zum Beispiel zeigte eine Phase-III-Studie ein verbessertes krankheitsfreies Überleben (DFS) und vorläufige Beweise, dass Atezolizumab (monoklonaler Antikörper gegen PD-L1) in Kombination mit nab-Paclitaxel einen Gesamtüberlebensvorteil im Vergleich zu nab-Paclitaxel allein bei Tumoren mit ≥1% PD-L1-Färbung bieten kann6. Die Entwicklung von Therapien, die Brusttumoren für eine Immuntherapie sensibilisieren, wird die Behandlungsschemata revolutionieren.
Präklinische Modelle, die die Heterogenität und das Ansprechen von Brustkrebs beim Menschen originalgetreu rekapitulieren, sind entscheidend für die Untersuchung der Tumorbiologie und die Identifizierung potenzieller Biomarker für eine gezielte Therapie. Immortalisierte Zelllinien werden häufig für die Brustkrebsforschung verwendet, da diese Zelllinien leicht zu züchten und genetisch verändert sind, um molekulare Mechanismen zu untersuchen. Aufgrund des selektiven Drucks durch langfristige Zellkultur in vitro kann es jedoch im Laufe der Zeit zu genetischer Drift kommen und Brustkrebszelllinien können zelllinienspezifische genomische Veränderungen tragen, die sich von Aberrationen in primären Brusttumoren unterscheiden7,8,9.
Patienten-abgeleitete Xenograft (PDX) Tumorblöcke sind in der Lage, die Heterogenität der menschlichen Krankheit zu rekapitulieren, und sind histologisch und immunhistochemisch dem Tumor des Ursprungs10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. Wichtig ist, dass PDX-Modelle phänotypisch stabil über mehrere Transplantationen hinweg sind, wie histologische, transkriptom-, Proteom- und genomische Analysenbelegen 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29. PDX-Modelle zeigen Behandlungsreaktionen, die mit denen vergleichbarsind,die klinisch beobachtet wurden10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27,28,29. PDX-Modelle für Östrogenrezeptor-positive (ER+),Progesteronrezeptor-positive (PR+),epidermale Wachstumsfaktor-2-positive (ERBB2+,HER2+)und dreifach negative Brustkrebs (TNBC) PDX-Modelle wurden etabliert und bieten eine hervorragende Plattform, um endokrine, chemo- und zielgerichtete Therapien zu testen. Ein Hauptvorbehalt der PDX-Modelle ist derzeit jedoch das Fehlen eines funktionierenden Immunsystems in der Maus.
Die gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEMM), wie Trp53 homozygote Null-, cMyc-, Wnt1-, PyMT- oder Her2-Überexpressionsmodelle, erlauben die Untersuchung spontaner Tumorinitiation, -progression und -metastasierung im Kontext eines intakten Immunsystems. Die Tumorlatenz ist jedoch lang, was es schwierig macht, präklinische Studien mit mehreren Armendurchzuführen 30,31. GEMM kann jedoch auf syngene Wirte transplantiert werden, um eine ausreichende Anzahl von Tumoren zu erzeugen, die die menschlichen Tumoren32,33,34 ,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50,51,52,53,54,55. Zum Beispiel wurde das Brustepithel einer p53-Null-BALB / c-Maus in die gereinigten Fettpolster syngener Wildtyp-Empfängermäuse transplantiert, um Primärtumoren zu bilden, die weiter in syngene Wirte transplantiert werden können56,57. Die p53-Null-Tumoren rekapitulierten verschiedene Subtypen menschlicher Tumoren.
Die Kombination von PDX-Modellen und transplantierbarem GEMM bietet wertvolle präklinische Werkzeuge zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion und der Antitumorimmunität. Im aktuellen Protokoll wird eine Methode der orthotopen Transplantation von PDX- und GEMM-Tumorfragmenten in das Brustfettpolster der Maus beschrieben. Diese Modelle sind für serielle Passagen geeignet und behalten in der Regel einen stabilen Phänotyp. Um das Risiko einer genetischen Drift oder eines Verlustes der Heterogenität über Passagen im Laufe der Zeit zu verringern, werden an jeder Passage mehrere Gewebefragmente für die anschließende Transplantation kryokonserviert, falls im Laufe der Zeit biologische oder morphologische Veränderungen beobachtet werden29,58.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

Präklinische Modelle, die Tumorheterogenität und therapeutisches Ansprechen originalgetreu rekapitulieren, sind für die translationale Brustkrebsforschung von entscheidender Bedeutung. Immortalisierte Zelllinien sind leicht zu züchten und genetisch zu modifizieren, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, aber der selektive Druck der Zellkultur führt im Laufe der Zeit oft zu genetischen und epigenetischen Veränderungen. Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) rekapitulieren die Heterogenität und Arzneimittelreaktion menschlicher Brusttumoren originalgetreu. PDX-Modelle weisen eine relativ kurze Latenz nach orthotopischer Transplantation auf, die die Untersuchung der Brusttumorbiologie und des Arzneimittelverhaltens erleichtert. Die transplantierbaren gentechnisch veränderten Mausmodelle ermöglichen die Untersuchung der Immunität von Brusttumoren. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Methode, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, gefolgt von medikamentösen Behandlungen. Diese präklinischen Modelle bieten wertvolle Ansätze zur Untersuchung der Brusttumorbiologie, der Arzneimittelreaktion, der Biomarkerentdeckung und der Mechanismen der Arzneimittelresistenz.

Abbildung 1 zeigt die Ausrüstung (Abbildung 1A) und die wichtigsten Verfahren (Abbildung 1B) der orthotopischen Transplantation. Abbildung 2 zeigt die Charakterisierung eines transplantierten PDX-Tumors (MC1). Tumorfragmente (1 mm3) des MC1-Modells wurden in das Fettpolster Nr. 4 von SCID/Beige-Mäusen transplantiert. Einen M...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Serie: Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Forschung

Krebsforschung

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Ultrasonographic Beurteilung von Brustkrebs im Zusammenhang mit Lymphödem

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

Die Anwendung von 1% Methylen blauer Farbstoff als eine einzige Technik in Brustkrebs Sentinel Node Biopsie

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

Modellierung von Brustkrebs im menschlichen Brustgewebe mit einem mikrophysiologischen System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are diagnosed with brain metastases each year. Significant progress has been made in improving survival outcomes for patients with primary breast cancer and systemic malignancies; however, the dismal prognosis for patients with clinical brain metastases highlights the urgent need to develop novel therapeutic agents and strategies against this deadly disease. The lack of suitable experimental models has been one of the major hurdles impeding advancement of our understanding of brain metastasis biology and treatment. Herein, we describe a xenograft mouse model of brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified cell line derived from inflammatory breast cancer (IBC), a rare and aggressive form of breast cancer. Cells were labeled with firefly luciferase and green fluorescence protein to monitor brain metastasis, and quantified metastatic burden by bioluminescence imaging, fluorescent stereomicroscopy, and histologic evaluation. Mice robustly and consistently develop brain metastases, allowing investigation of key mediators in the metastatic process and the development of preclinical testing of new treatment strategies.

We describe a xenograft mouse model of breast cancer brain metastasis generated via tail-vein injection of an endogenously HER2-amplified inflammatory breast cancer cell line.

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...