O objetivo deste protocolo é identificar um método que pode ser usado para identificar novos genes que estão envolvidos na sinalização de cálcio. Para fazer isso, usamos a clássica tela genética para a frente. A sinalização de cálcio é um importante caminho de resposta à defesa em vários sistemas vegetais.
Para identificar os genes envolvidos nesse caminho, usamos a tela genética clássica para a frente. Neste método, o EMS seria usado como um agente alquilante para introduzir mutações aleatórias nos sistemas vegetais. A geração mutante desenvolvida pode então ser usada para triagem para um fenótipo de interesse.
Uma vez identificado o fenótipo de interesse, o gene causal pode ser mapeado. Neste estudo, utilizamos a planta modelo Arabidopsis que tem a repórter de cálcio aequorin em seu espectro. Pese 150 mg de sementes de aequorina para mutagênese EMS e outras sementes de 150 mg para serem usadas como controle.
Transfira as sementes para um tubo Falcon de 50 ml e adicione 2% DES ou água autoclavada. Ao usar o EMS, tenha cuidado porque é cancerígeno. As engrenagens de proteção devem ser usadas durante o uso de EMS e qualquer tipo de derramamento deve ser evitado.
Sele os tubos Falcão com parafina e enrole-o com papel alumínio. Gire a extremidade do tubo por 18 horas em temperatura ambiente. Permita que as sementes se instalem e removam cuidadosamente a solução EMS e descarte em um recipiente de resíduos contendo um NaOH molar.
Lave bem as sementes mutagenizadas com 40 ml de água autoclavada pelo menos oito vezes. Para a lavagem final, adicione 100 mililitros de tiossulfito de sódio e enxágue pelo menos três vezes para remover traços de EMS. Mergulhe as sementes em 40 ml de água autoclavada por uma hora para difundir o EMS das sementes e, em seguida, coloque-as no papel Whatman até secar completamente.
Transfira as sementes para Eppendorf e incubar a quatro graus Celsius por dois a quatro dias para estratificação. Transfira as sementes mutagenizadas e as sementes tratadas com água para o solo e transfira-as para salas de crescimento com luz de 16 horas e período de oito horas de foto escura a 22 graus Celsius e 70% de umidade relativa. Para determinar se a mutagênese foi bem sucedida, procure o setor de clorofila.
Usamos o único método de coleta de sementes à base de pedigree e cada planta M1 recebe um número único. Após a maturação, as sementes são colhidas dessas plantas mutantes individuais e armazenadas como linhas M1 individuais. É utilizado um protocolo de esterilização de sementes de alto rendimento e protocolo radicular de plantas hidropônicas, adaptado de Ranf et al.
No primeiro dia, coloque cerca de 12 a 15 sementes M2 por M1 uma linha em poços individuais de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e esterilize usando hipoclorito de sódio e solução de ácido clorídrico em uma proporção de três é para um. Isso libera gás cloro que esteriliza as sementes. Deixe a placa durante a noite para evaporar completamente o gás cloro restante.
Após a esterilização, adicione mídia líquida de MS de meia resistência aos poços individuais e estratize as sementes por dois a quatro dias a quatro graus Celsius, e depois mova as sementes para uma câmara de crescimento com período de foto de 10 horas de luz e 14 horas escuras a 22 graus Celsius, 70% de umidade relativa. No dia 14, uma vez que as mudas têm de oito a 12 dias, coloque 12 mudas M2 de cada linha individualmente em uma placa de 96 poços de luminômetro. Após a transferência de mudas, adicione 150 microliters de cinco soluçãos de coelenterazina micromolar em poços individuais e armazene no escuro a 21 graus Celsius por oito horas.
Coelenterazine é um grupo protético que se liga à apoaequorina para formar aequorina funcional. A coelenterazina é sensível à luz e, portanto, é armazenada em garrafas de cor escura protegidas da luz. No dia seguinte, mutantes de tela usando peróxido de hidrogênio como estímulo e medem a elevação subsequente do cálcio.
Para medição simultânea de 24 poços, é feito um programa cinético automatizado, que inclui medir o fundo por um minuto, seguido de adição e medição de estímulo por 10 minutos, seguido de injeção de descarga de 150 microliter e medição por três a cinco minutos. E qualquer descarga para a filha aequorin seria incluída na leitura para quantificar o cálcio medido e como controle adicional para aequorina funcional. As leituras fornecidas a partir do método acima estão em unidades de luz relativas.
Para calcular a concentração de íons de cálcio citosóis, é utilizada uma equação de concentração previamente descrita dada por Rental e Knight em 2004, que está descrita no protocolo. As RLUs obtidas a partir do luminômetro são adicionadas à equação para calcular a concentração de íons de cálcio. Os valores de íons de cálcio citosóicos obtidos são então graficamente plotados contra um controle do tipo selvagem para identificar mutantes de peróxido de hidrogênio putativo para resposta ao cálcio.
Este é um resultado representativo do protocolo mostrado. Mostramos uma linha M1 com 12 mudas individuais que foram medidas para elevação da concentração de íons de cálcio. A linha verde no gráfico indica aequorina tipo selvagem que foi medida junto com mutantes.
Vermelho é a média de todas as 12 mudas, e linha preta é mudas individuais M2 medidas para a elevação de íons de cálcio. As mudas que mostram uma resposta altamente reduzida à aplicação de peróxido de hidrogênio são então resgatadas. Mutantes resgatados são então reconfirmados na próxima geração, seguidos de mapeamento para identificar genes causais.
Deve-se ter cuidado ao usar o EMS como mutagênico, já que é um cancerígeno. A engrenagem protetora deve ser usada o tempo todo e qualquer derramamento feito deve ser tratado com boas práticas laboratoriais. Além disso, ao fazer uma coleção de sementes à base de pedigree, as plantas individuais devem ser colhidas com o maior cuidado para que não haja mistura de sementes em nenhum estágio.
Isso vai ajudar alguém a voltar e rastrear a planta mãe, que é a planta mutante homozigous. Além disso, uma vez que este método não introduz qualquer viés ou quaisquer suposições anteriores no método de triagem, ele pode ser usado para uma ou mais condições para identificar um fenótipo de interesse. Além disso, vários genes independentes também poderiam ser identificados usando o mesmo protocolo.
O protocolo é fácil de usar, pois com a pequena dosagem, um grande número de plantas pode ser mutagenizado. Este grande número de plantas mutantes pode ser usado para várias populações e para várias condições e para identificar vários genes. Uma perda parcial de função, uma função alterada, uma perda completa da função ou também função genética constitutiva podem ser identificadas através deste método.
O mapeamento deve ser uma tarefa fácil dado o avanço das tecnologias de mapeamento nos cenários atuais. Um sistema de mapeamento baseado em novo, uma conspiração racial baseada em SNP e muitos outros podem ser usados para identificar o gene causal que causa o fenótipo de interesse. Dada a aplicabilidade deste método, ele pode ser usado não apenas nas plantas modelo Arabidopsis, mas em outras plantas modelo também desde que um fenótipo de leitura de interesse possa ser estabelecido.
