FILM-FRET es una potente técnica que permite confirmar sospechas o predichas interacciones proteína-proteína. En este protocolo, presentamos una forma de analizar datos en casos particulares de cantidades de donantes y aceptantes desequilibradas. FILM-FRET es capaz de proporcionar información sobre las interacciones proteína-proteína directamente en células vivas.
Es importante investigar las interacciones personales-proteínas en el entorno celular nativo, en particular cuando la proteína fluorescente se expresa en el nivel endógeno. Comience por el crecimiento de P.aeruginosa, E.coli TOP10, y E.coli bacterias auxiliares cada uno en cinco mililitros de LB sin antibióticos a 30 grados Celsius mientras se agita durante la noche. Al día siguiente, mida la densidad óptica de los cultivos y mezcle una cantidad igual de P.aeruginosa, E.coli TOP10 y E.coli ayudante en un microtubo de 1,5 mililitros.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 9,300 veces G para peletizar las bacterias, luego desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 50 microlitros de LB. Pída una mancha de la mezcla en el agar LB precalentado y incuba durante cinco horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, raspar el punto con un lazo de inoculación estéril y resuspenderlo en un mililitro de LB. Placa 100 microlitros de esta suspensión bacteriana en agar LB que contiene 10 microgramos por mililitrolitor cloramphenicol y 30 microgramos por mililitro gentamicina e incubar dos días a 37 grados Celsius para eliminar las bacterias auxiliares E.coli TOP10 y E.coli. Resuspender una colonia en un mililitro de LB e incubarlo a 37 grados Celsius con temblor orbital durante cuatro horas, luego centrifugar el tubo durante tres minutos a 9.300 veces G y desechar 950 microlitros de sobrenadante.
Resuspender el pellet en 50 microlitros de LB y aislar la mezcla en agar LB que contiene sacarosa y sin cloruro de sodio. Incubar la placa durante la noche a 30 grados centígrados. Detectar colonias aisladas en el agar LB y el agar LB que contiene 15 miligramos por mililitro gentamicina con el fin de comprobar la sensibilidad a la gentamicina.
Coloque un portaobjetos de vidrio de microscopio sobre una superficie horizontal plana y coloque dos diapositivas de vidrio rematadas con dos capas de cinta adhesiva a su alrededor. Pipetear una gota de 70 microlitros de 1% de agarosa fundida en el tobogán de vidrio y colocar una cuarta diapositiva en la parte superior para aplanar la gota de agarosa. Presione suavemente durante aproximadamente un minuto.
Quítese el portaobjetos superior y deje caer alrededor de tres microlitros de bacterias en tres a cuatro puntos en diferentes lugares de la almohadilla de agarosa. Cubra la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de vidrio de microscopía y fíjela con parafina fundida para sellándola en el portaobjetos de vidrio comenzando con las cuatro esquinas. Coloque la diapositiva de la microscopía en el escenario con el cubreobjetos mirando hacia el objetivo.
Gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo eGFP y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia, luego envíe la luz de fluorescencia hacia el ocular del microscopio. Enfoque el objetivo en las bacterias utilizando la perilla del microscopio. Seleccione una región de interés en la muestra utilizando el joystick que controla la etapa motorizada.
Envíe la ruta de emisión de fluorescencia hacia el detector, luego gire la torreta del cubo del filtro para seleccionar el cubo dicroico para el láser de 930 nanómetros y establezca la potencia del láser en 20 milivatios. Establezca el tamaño de la región de interés en 30 micrómetros que ajuste la tensión que opera los espejos galvo y define el rango de sus movimientos. Encienda el detector y comience a escanear la muestra.
Elija el campo de visión de la imagen moviendo con firmez el escenario desde la interfaz del ordenador. Esto se puede hacer en la configuración moviendo la cruz en la imagen en el software de control del microscopio que definirá el nuevo centro de la imagen y presionando la etapa de movimiento. Un buen campo de visión para la adquisición debe contener de 10 a 30 bacterias inmóviles, todas enfocadas.
Si está interesado en extraer datos film-FRET de células individuales, asegúrese de que las bacterias estén bien individualizadas. Abra el software de imágenes y compruebe que la tasa de recuento de fotones no es demasiado alta para evitar un efecto de acumulación que puede influir en las mediciones de por vida. Si es necesario, reduzca la intensidad del láser para mantener la tasa de recuento de fotones baja.
Ajuste los parámetros de adquisición, incluido el tiempo de recogida de la adquisición. Pulse el botón de inicio y espere a que finalice la adquisición. Para analizar los datos, abra RStudio y cree un nuevo proyecto.
Cree una nueva carpeta en la carpeta principal del proyecto y asígnele el nombre data y, a continuación, mueva todos los archivos de solicitud de análisis a esta carpeta. Abra un nuevo archivo de script o el script complementario flim_analysis.r. Instale el paquete FlimDiagRam dedicado para el análisis de datos de película y llame al paquete en el área de trabajo.
Aquí se muestran las funciones de distribución acumulativa empírica de la vida útil de la fluorescencia medida para las diferentes cepas bacterianas. Si se produce FRET, las funciones se desplazan hacia las vidas más cortas. Es importante tener en cuenta que el FRET no puede ocurrir cuando la interacción de las dos proteínas resulta en una larga distancia entre los dos fluróforos, que no se pueden distinguir de la ausencia de interacción.
Por lo tanto, puede ser necesario etiquetar las proteínas en diferentes posiciones para maximizar las posibilidades de sondear la interacción. Debido a la gran diferencia en las expresiones proteicas entre PvdA y PvdL, el mismo complejo no da lugar a datos FILM-FRET similares. Las estequiometrías desequilibradas conducen a diferencias en la contribución de los libres en comparación con las proteínas etiquetadas por donantes en la distribución de por vida de fluorescencia registrada.
La gráfica de diagrama se puede utilizar para proporcionar información crítica sobre la estequiometría. En el mutante PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la cantidad de PvdA con etiqueta de donante es mucho mayor que la cantidad de mCherry-PvdL. Entre todos los donantes presentes en la muestra, sólo unos pocos de ellos están interactuando con PvdL.
El único valor tau centrado en aproximadamente 2,3 nanosegundos sugiere que cada donante PvdA-eGFP solo puede transferirse con un aceptador mCherry-PvdL. Cuando se invierte el etiquetado, se espera que la mayoría de las proteínas eGFP-PvdL interactúen con PvdA-mCherry, lo que se confirma por los valores alfa uno más altos. Los valores tau uno se volvieron más distribuidos, lo que sugiere que múltiples proteínas JcdA pueden unirse a una sola proteína JcdL.
La configuración de FLIM está disponible en un número cada vez mayor de instalaciones de imágenes. Las muestras de imágenes en un FILM-FRET no son más complicadas que las imágenes en microscopía de vídeo.
