FILM-FRET est une technique puissante qui permet de confirmer les interactions protéine-protéine suspectées ou prévues. Dans ce protocole, nous présentons un moyen d’analyser les données dans des cas particuliers de donneurs déséquilibrés et de quantités d’accepteur. FILM-FRET est en mesure de fournir des informations sur les interactions protéine-protéine directement dans les cellules vivantes.
Il est important d’étudier les interactions personal-protéine dans l’environnement cellulaire indigène, en particulier lorsque les protéines fluorescentes sont exprimées au niveau endogène. Commencez par cultiver des bactéries P.aeruginosa, E.coli TOP10 et E.coli dans cinq millilitres de LB sans antibiotique à 30 degrés Celsius tout en secouant pendant la nuit. Le lendemain, mesurez la densité optique des cultures et mélangez une quantité égale d’aide P.aeruginosa, E.coli TOP10 et E.coli dans un microtube de 1,5 millilitre.
Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 9300 fois G pour pelleter les bactéries, puis jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 50 microlitres de LB. Plaquez une tache du mélange sur une agar LB préchauffée et incubez-la pendant cinq heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, racler l’endroit avec une boucle stérile d’inoculation et le résusquer en un millilitre de LB. Plaque 100 microlitres de cette suspension bactérienne sur l’agar LB contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphéniphéniol et 30 microgrammes par géntamycine millilitre et incuber deux jours à 37 degrés Celsius pour éliminer les bactéries E.coli TOP10 et E.coli helper. Resuspendez une colonie en un millilitre de LB et incubez-la à 37 degrés Celsius avec des secousses orbitales pendant quatre heures, puis centrifugez le tube pendant trois minutes à 9 300 fois G et jetez 950 microlitres de supernatant.
Resuspendez la pastille dans 50 microlitres de LB et isolez le mélange sur l’agar LB contenant du saccharose et pas de chlorure de sodium. Incuber la plaque pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Repérons les colonies isolées sur l’agar LB et l’agar LB contenant 15 milligrammes par géntamycine millilitre afin de vérifier la sensibilité à la géntamycine.
Placez une glissière en verre microscope sur une surface horizontale plane et disposez deux glissières en verre surmontées de deux couches de ruban adhésif autour d’elle. Pipette une gouttelette de 70 microlitres de 1% d’agarose fondue sur la glissière de verre et placez une quatrième glissière sur le dessus pour aplatir la gouttelette d’agarose. Appuyez doucement pendant environ une minute.
Enrôez la glissière supérieure et déposez environ trois microlitres de bactéries en trois à quatre endroits à différents endroits sur la garniture d’agarose. Couvrez le tampon d’agarose d’un couvercle en verre microscopie et fixez-le avec de la paraffine fondue pour le sceller sur la glissière de verre en commençant par les quatre coins. Placez la diapositive de microscopie sur la scène avec le coverslip face à l’objectif.
Tournez la tourelle du cube filtrant pour sélectionner le cube eGFP et ouvrez l’obturateur de la lampe de fluorescence, puis envoyez la lumière de fluorescence vers l’oculaire du microscope. Concentrez l’objectif sur les bactéries à l’aide du bouton microscope. Sélectionnez une région d’intérêt pour l’échantillon à l’aide du joystick qui contrôle l’étape motorisée.
Renvoyez le chemin d’émission de fluorescence vers le détecteur, puis tournez en arrière la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube dichroïque pour le laser de 930 nanomètres et réglez la puissance laser à 20 milliwatts. Réglez la taille de la région d’intérêt à 30 micromètres qui ajuste la tension de fonctionnement des miroirs galvo et définit la gamme de leurs mouvements. Allumez le détecteur et commencez à scanner l’échantillon.
Choisissez le champ de vision pour l’imagerie en déplaçant finement la scène de l’interface de l’ordinateur. Cela peut être fait sur la configuration en déplaçant la croix sur l’image dans le logiciel de contrôle du microscope qui définira le nouveau centre de l’image et en appuyant sur l’étape de déplacement. Un bon champ de vision pour l’acquisition devrait contenir 10 à 30 bactéries immobiles toutes au point.
Si vous êtes intéressé à extraire des cellules individuelles FILM-FRET données, assurez-vous que les bactéries sont bien individualisées. Ouvrez le logiciel d’imagerie et vérifiez que le taux de comptage des photons n’est pas trop élevé pour éviter un effet de carambolage qui peut influencer les mesures à vie. Si nécessaire, abaissez l’intensité du laser pour maintenir le taux de nombre de photons bas.
Ajuster les paramètres d’acquisition, y compris le temps de collecte des acquisitions. Appuyez sur le bouton de démarrage et attendez la fin de l’acquisition. Pour analyser les données, ouvrez RStudio et créez un nouveau projet.
Créez un nouveau dossier dans le dossier de projet principal et nommez-le, puis déplacez toutes les analyses demandez des fichiers dans ce dossier. Ouvrez un nouveau fichier script ou le script supplémentaire flim_analysis.r. Installez le package FlimDiagRam dédié pour l’analyse des données de film et appelez le paquet dans l’espace de travail.
Les fonctions cumulatives empiriques de distribution des durées de vie de fluorescence mesurées pour les différentes souches bactériennes sont montrées ici. Si fret se produit, les fonctions sont déplacées vers les durées de vie plus courtes. Il est important de noter que fret ne peut pas se produire lorsque l’interaction des deux protéines se traduit par une longue distance entre les deux flurophores, qui ne peut pas être distingué de l’absence d’interaction.
Par conséquent, il peut être nécessaire d’étiqueter les protéines à différentes positions pour maximiser les chances de sonder l’interaction. En raison de la grande différence dans les expressions protéiques entre PvdA et PvdL, le même complexe n’entraîne pas de données FILM-FRET similaires. Les stoichiometries déséquilibrées conduisent à des différences dans la contribution du libre par rapport aux protéines lbellisée par donneur liées dans la distribution à vie de fluorescence enregistrée.
L’intrigue du diagramme peut être utilisée pour fournir des informations critiques sur la stoichiométrie. Dans le mutant PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la quantité de PvdA étiqueté par donneur est beaucoup plus élevée que la quantité de mCherry-PvdL. Parmi tous les donneurs présents dans l’échantillon, seuls quelques-uns d’entre eux interagissent avec le PvdL.
La seule valeur tau one centrée à environ 2,3 nanosecondes suggère que chaque donneur PvdA-eGFP ne peut transférer qu’avec un accepteur mCherry-PvdL. Lorsque l’étiquetage est inversé, la plupart des protéines eGFP-PvdL devraient interagir avec PvdA-mCherry, ce qui est confirmé par les valeurs alpha-un plus élevées. Les valeurs tau one sont devenues plus distribuées suggérant que plusieurs protéines PvdA peuvent se lier à une seule protéine PvdL.
La configuration FLIM est de plus en plus disponible dans un nombre croissant d’installations d’imagerie. Les échantillons d’imagerie dans un FILM-FRET ne sont pas plus compliqués que l’imagerie en microscopie vidéo.
