FILM-FRET는 의심하거나 예측된 단백질 단백질 상호 작용을 확인할 수 있게 하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜에서는 불균형 기증자 및 수락자 수량의 특정 한 경우 데이터를 분석하는 방법을 제시합니다. FILM-FRET는 살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용에 대한 정보를 직접 제공할 수 있다.
특히 형광 단백질이 내인성 수준에서 발현될 때, 토착 세포 환경에서 개인 단백질 상호 작용을 조사하는 것이 중요합니다. P.aeruginosa성장에 의해 시작, 대장균 TOP10, 그리고 E.coli 도우미 박테리아는 하룻밤 동안 흔들리는 동안 섭씨 30도에서 항생제없이 LB의 5 밀리리터에 각각. 다음 날, 배양의 광학 밀도를 측정하고 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 P.aeruginosa, E.coli TOP10 및 E.coli 도우미의 동일한 양을 혼합합니다.
9, 300회 G에서 5분 동안 튜브를 원심분리한 다음, 상류체를 버리고 LB의 50마이크로리터에서 펠릿을 재연합니다. 예열된 LB 한천에 혼합물의 반점을 접시에 넣고 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 멸균 접종 루프로 그 자리를 긁어 내고 LB의 1 밀리리터로 다시 중단하십시오. 플레이트 100 마이크로 리터 포함 LB 천에 밀리 리터 클로람페니콜 당 10 마이크로 그램과 30 밀리 리터 gentamycin 당 마이크로 그램과 E.coli TOP10 및 E.coli 도우미 박테리아를 제거하기 위해 섭씨 37도에서 이틀 배양. 한 식민지를 LB의 1밀리리터로 재차 중단하고 4시간 동안 궤도 흔들림으로 섭씨 37도에서 배양한 다음 9, 300회 G에서 3분 동안 튜브를 원심분리하고 950마이크로리터의 상퍼리터를 폐기합니다.
LB의 50 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하고 자당과 염화 나트륨을 포함하는 LB 화분에 혼합물을 분리합니다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 30도에서 배양하십시오. LB 한천과 LB 한천에 분리된 식민지를 발견하여 겐타마이신 감도를 확인하기 위해 밀리리터 젠타마이신당 15밀리그램을 함유하고 있습니다.
평평한 수평 표면에 현미경 유리 슬라이드를 놓고 두 개의 유리 슬라이드를 주위에 접착제 테이프로 얹어 놓습니다. 1%의 녹은 아가로즈 70개의 마이크로리터 액적 인 파이펫은 유리 슬라이드에 네 번째 슬라이드를 놓고 아가로즈 방울을 평평하게합니다. 약 1분 동안 부드럽게 누릅니다.
상부 슬라이드를 벗고 아가로즈 패드의 다른 위치에서 3~4개의 지점에서 약 3개의 마이크로리터의 박테리아를 떨어뜨립니다. 아가로즈 패드를 현미경 유리 커버슬립으로 덮고 녹인 파라핀으로 고정하여 네 개의 모서리로 시작하는 유리 슬라이드에 밀봉합니다. 목표에 직면 커버 슬립과 함께 무대에 현미경 슬라이드를 배치합니다.
필터 큐브 포탑을 돌려 eGFP 큐브를 선택하고 형광 램프 셔터를 열고 현미경의 안면쪽으로 형광광을 보냅니다. 현미경 손잡이를 사용하여 박테리아에 목표를 집중하십시오. 전동 스테이지를 제어하는 조이스틱을 사용하여 샘플에 관심 영역을 선택합니다.
형광 방출 경로를 검출기로 다시 보낸 다음 필터 큐브 포탑을 돌려 930 나노미터 레이저용 디크로이크 큐브를 선택하고 레이저 전력을 20 밀리와트로 설정합니다. 관심 영역의 크기를 갈보 거울을 작동하는 전압을 조정하고 움직임 범위를 정의하는 30 마이크로미터로 설정합니다. 검출기를 켜고 샘플 스캔을 시작합니다.
컴퓨터 인터페이스에서 스테이지를 미세하게 이동하여 이미징을 위한 시야를 선택합니다. 이는 이미지의 새로운 중심을 정의하고 이동 단계를 누르는 현미경 제어 소프트웨어에서 이미지의 십자가를 이동하여 설정에서 수행 할 수 있습니다. 취득을 위한 보기의 좋은 필드는 10 에서 30 모든 초점에 있는 움직이지 않는 박테리아를 포함해야 합니다.
단일 세포 FILM-FRET 데이터를 추출하는 데 관심이 있다면 박테리아가 잘 개별화되었는지 확인하십시오. 이미징 소프트웨어를 열고 광자 수비율이 너무 높지 않아 평생 측정에 영향을 줄 수 있는 더미 효과를 피하십시오. 필요한 경우 레이저 강도를 낮추어 광자 수 속도를 낮춥시게 합니다.
수집 시간을 포함하여 획득 매개 변수를 조정합니다. 시작 버튼을 누르고 획득이 완료될 때까지 기다립니다. 데이터를 분석하려면 RStudio를 열고 새 프로젝트를 만듭니다.
메인 프로젝트 폴더에 새 폴더를 만들고 데이터 이름을 지정한 다음 모든 분석 요청 파일을 이 폴더로 이동합니다. 새 스크립트 파일 또는 보충 스크립트 flim_analysis.r을 엽니다. 필름 데이터 분석을 위해 전용 FlimDiagRam 패키지를 설치하고 작업 공간에서 패키지를 호출합니다.
상이한 세균균에 대해 측정된 형광 수명의 경험적 누적 분포 기능은 여기에 도시된다. FRET가 발생하면 함수가 수명이 짧아지며 이동합니다. FRET는 두 단백질의 상호 작용이 상호 작용의 부재와 구별 될 수없는 두 플루로포사이의 긴 거리를 초래 할 때 발생할 수 없다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
따라서, 상호 작용을 탐구의 기회를 최대화하기 위하여 다른 위치에 단백질을 표지하는 것이 필요할 지도 모릅니다. PvdA와 PvdL 사이의 단백질 발현의 큰 차이로 인해 동일한 복합체가 유사한 FILM-FRET 데이터를 초래하지 않습니다. 불균형한 스토이치오메트리는 기록된 형광 수명 분포에서 결합된 기증자 표지 단백질과 비교하여 자유의 기여도의 차이로 이어집니다.
다이어그램 플롯을 사용하여 스토이치오메트리에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다. PvdA-eGFP mCherry-PvdL 돌연변이체에서는 기증자 라벨이 부착된 PvdA의 양이 mCherry-PvdL의 양보다 훨씬 높습니다. 샘플에 존재하는 모든 기증자 들 사이에서, 그들 중 몇몇만이 PvdL과 상호 작용하고 있습니다.
약 2.3 나노초를 중심으로 한 단일 타우 1값은 각 PvdA-eGFP 기증자가 하나의 mCherry-PvdL 수락자로만 전송할 수 있음을 시사합니다. 라벨링이 반전되면 대부분의 eGFP-PvdL 단백질은 더 높은 알파 1값에 의해 확인된 PvdA-mCherry와 상호 작용할 것으로 예상됩니다. 타우 1값은 다중 PvdA 단백질이 단일 PvdL 단백질에 결합될 수 있음을 시사하는 더 분산되었다.
FLIM 설치는 점점 더 많은 이미징 시설에서 사용할 수 있게 되고 있습니다. FILM-FRET의 이미징 샘플은 비디오 현미경 검사에서 이미징보다 더 복잡하지 않습니다.
