FİlM-FRET, şüpheli veya tahmin edilen protein-protein etkileşimlerini doğrulamayı mümkün kılan güçlü bir tekniktir. Bu protokolde, belirli durumlarda dengesiz donör ve alıcı miktarları olan verileri analiz etmenin bir yolunu sıyoruz. FİlM-FRET canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri hakkında bilgi verebilir.
Doğal hücresel ortamda kisisel-protein etkileşimlerini araştırmak önemlidir, özellikle floresan protein endojen düzeyde ifade edildiğinde. P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcı bakteri her büyüyen başlayın LB beş mililitre antibiyotik olmadan 30 derece santigrat gece sallayarak. Ertesi gün, kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün ve 1,5 mililitrelik mikrotüpte eşit miktarda P.aeruginosa, E.coli TOP10 ve E.coli yardımcısını karıştırın.
Tüpü 9, 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatant'ı atın ve 50 mikrolitre LB'de peleti yeniden askıya alın. Önceden ısıtılmış LB agar üzerinde karışımın bir nokta plaka ve 37 santigrat derece beş saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, steril bir aşı lama döngüsü ile nokta kazıyın ve LB bir mililitre resuspend. Plaka 100 mililitre kloramfenikol başına 10 mikrogram ve mililitre gentamycin başına 30 mikrogram içeren LB agar bu bakteriyel süspansiyon mikrolitre ve e.coli TOP10 ve E.coli yardımcı bakterileri ortadan kaldırmak için 37 derece santigrat iki gün kuluçka. LB bir mililitre bir koloni resuspend ve dört saat boyunca orbital sallayarak 37 santigrat derece kuluçka, sonra 9, 300 kez G üç dakika için tüp santrifüj ve supernatant 950 mikrolitre atın.
LB 50 mikrolitre pelet resuspend ve sakaroz ve sodyum klorür içeren LB agar karışımı izole. Tabağı bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Mililitre gentamisin başına 15 miligram içeren LB agar ve LB agar spot izole koloniler amacıyla gentamisin duyarlılığı kontrol etmek için.
Düz yatay bir yüzeye bir mikroskop cam slayt yerleştirin ve etrafında yapışkan bant iki kat ile tepesinde iki cam slaytlar düzenlemek. Pipet% 1 erimiş agarose 70 mikrolitre damlacık cam slayt üzerine ve agarose damlacık düzleştirmek için üstüne dördüncü bir slayt yerleştirin. Yaklaşık bir dakika boyunca hafifçe bastırın.
Üst slayt çıkarmak ve agarose ped üzerinde farklı yerlerde üç ila dört noktalar bakteri yaklaşık üç mikrolitre bırakın. Agarose pedi bir mikroskopi cam kapak lı kaplayın ve dört köşeden başlayarak cam kaydırağa yapıştırmak için erimiş parafinle düzeltin. Mikroskopi slaytını hedefe bakan kapak lı olarak sahneye yerleştirin.
eGFP küpünü seçmek için filtre küptürüntürününü çevirin ve floresan lamba deklanşörünü açın, ardından floresan ışığını mikroskopun merceğine doğru gönderin. Mikroskop tonlarını kullanarak bakterilerin amacıodaklanın. Motorlu sahneyi kontrol eden joystick'i kullanarak numunenin ilgi çekici bir bölgesini seçin.
Floresan emisyon yolunu dedektöre geri gönderin, ardından 930 nanometre lazer için dikroik küpü seçmek ve lazer gücünü 20 miliwatt'a ayarlamak için filtre küptürüntürüngeri dönün. Galvo aynaları çalıştıran gerilimi ayarlayan ve hareketlerinin aralığını tanımlayan 30 mikrometreye kadar ilgi alanının boyutunu ayarlayın. Dedektörü açın ve örneği taramaya başlayın.
Sahneyi bilgisayar arabiriminden ince bir şekilde hareket ettirerek görüntüleme için görüş alanını seçin. Bu, görüntünün yeni merkezini tanımlayacak mikroskop kontrol yazılımındaki görüntü üzerindeki haçı hareket ettirerek ve taşıma aşamasına basarak kurulumda yapılabilir. Edinim için iyi bir görüş alanı 10 ila 30 hareketsiz bakteri tüm odak içermelidir.
Tek hücre film-FRET veri ayıklama ilgileniyorsanız, bakteri iyi bireyselleştirilmiş olduğundan emin olun. Görüntüleme yazılımını açın ve foton sayımı oranının ömür boyu ölçümleri etkileyebilen bir yığın etkisinden kaçınmak için çok yüksek olmadığını kontrol edin. Gerekirse, foton sayımı oranını düşük tutmak için lazer yoğunluğunu düşürün.
Edinme toplama süresi de dahil olmak üzere edinme parametrelerini ayarlayın. Başlat düğmesine basın ve satın almanın tamamlanmasını bekleyin. Verileri analiz etmek için RStudio'yu açın ve yeni bir proje oluşturun.
Ana proje klasöründe yeni bir klasör oluşturun ve veri adını, sonra tüm çözümleme bu klasöre dosyaları sormak taşıyın. Yeni bir komut dosyası dosyası veya ek komut dosyası flim_analysis.r açın. Film veri analizi için özel FlimDiagRam paketini yükleyin ve paketi çalışma alanında arayın.
Farklı bakteriyel suşlar için ölçülen floresan ömürlerinin ampirik kümülatif dağılım fonksiyonları burada gösterilmiştir. FRET oluşursa, işlevler daha kısa ömürlü yaşam sürelerine kaydırılır. Bu FRET iki protein etkileşimi etkileşimi etkileşim yokluğunda ayırt edilemez iki flurofors arasında uzun bir mesafe ile sonuçlandığında oluşabilir dikkat etmek önemlidir.
Bu nedenle, etkileşimi sondalama şansını en üst düzeye çıkarmak için proteinleri farklı konumlarda etiketlemek gerekebilir. PvdA ve PvdL arasındaki protein ifadelerindeki büyük fark nedeniyle, aynı kompleks benzer FİLO-FRET verilerine neden olmaz. Dengesiz stoiyometries kaydedilen floresan ömür boyu dağılımında bağlı donör etiketli proteinler ile karşılaştırıldığında ücretsiz katkısı farklılıklara yol açar.
Diyagram çizimi stoiyometri hakkında kritik bilgiler sağlamak için kullanılabilir. PvdA-eGFP mCherry-PvdL mutantında, donör etiketli PvdA miktarı mCherry-PvdL miktarından çok daha yüksektir. Örnekte bulunan tüm bağışçılar arasında, sadece birkaçı PvdL ile etkileşim halindedir.
Yaklaşık 2,3 nanosaniye merkezli tek tau bir değer, her PvdA-eGFP donörün sadece bir mCherry-PvdL alıcısı ile transfer edilebilmeyi önerir. Etiketleme tersine çevrildiğinde, eGFP-PvdL proteinlerinin çoğunun pvda-mCherry ile etkileşime geçmesi beklenir ve bu da yüksek alfa bir değerleri ile doğrulanır. Tau bir değerleri birden fazla PvdA proteininin tek bir PvdL proteinine bağlanabileceğini düşündüren daha fazla dağıtılmış hale geldi.
FLIM kurulumu giderek artan sayıda görüntüleme tesisinde kullanıma sunuluyor. FİlM-FRET'deki görüntüleme örnekleri video mikroskobundaki görüntülemeden daha karmaşık değildir.
