FILM-FRET هي تقنية قوية تجعل من الممكن تأكيد التفاعلات البروتينية البروتينية المشتبه بها أو المتوقعة. في هذا البروتوكول، نقدم طريقة لتحليل البيانات في حالات معينة من الكميات غير المتوازنة من المتبرع والمقبِل. فيلم-فريت قادرة على تقديم معلومات حول التفاعلات البروتين البروتينية مباشرة في الخلايا الحية.
من المهم التحقق من تفاعلات البروتينات الشخصية في البيئة الخلوية الأصلية، خاصة عندما يتم التعبير عن البروتين الفلوري في المستوى المحلي. تبدأ من قبل تزايد P.aeruginosa, E.coli TOP10, والبكتيريا مساعد الإشريكية القولونية كل في خمسة ملليلتر من LB دون مضاد حيوي في 30 درجة مئوية في حين تهتز بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وقياس الكثافة البصرية للثقافات وخلط كمية متساوية من P.aeruginosa، E.coli TOP10 ومساعد الإشريكية القولونية في 1.5 ملليلتر microtube.
الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 9، 300 مرة G إلى بيليه البكتيريا، ثم التخلص من supernatant وإعادة بناء بيليه في 50 ميكرولترات من LB. لوحة بقعة من الخليط على أجار LB محمّاة مسبقاً واحتضانه لمدة خمس ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، كشط البقعة مع حلقة تطعيم عقيمة وإعادة تعليقها في ملليلتر واحد من LB. لوحة 100 ميكرولترات من هذا التعليق البكتيري على LB أجار تحتوي على 10 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول و 30 ميكروغرام لكل ملليلتر gentamycin واحتضان يومين في 37 درجة مئوية للقضاء على E.coli TOP10 و E.coli البكتيريا مساعد. resuspend مستعمرة واحدة في ملليلتر واحد من LB واحتضانها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز المداري لمدة أربع ساعات، ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة ثلاث دقائق في 9، 300 مرة G والتخلص من 950 ميكرولترات من supernatant.
Resuspend بيليه في 50 ميكرولترات من LB وعزل الخليط على LB agar التي تحتوي على السكروز ولا كلوريد الصوديوم. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. بقعة المستعمرات المعزولة على LB أجار و LB أجار التي تحتوي على 15 ملليغرام لكل ملليلتر gentamycin من أجل التحقق من حساسية gentamycin.
ضع شريحة زجاجية مجهرية على سطح أفقي مستو وارتب انزلاقين زجاجيين تعلوهما طبقتان من الشريط اللاصق حوله. Pipette 70 قطرات ميكرولتر من 1٪ ذاب agarose على الشريحة الزجاجية ووضع شريحة رابعة على القمة لتسطيح قطرات agarose. اضغط لأسفل بلطف لمدة دقيقة تقريبا.
خلع الشريحة العليا وإسقاط حوالي ثلاثة ميكرولترات من البكتيريا في ثلاثة إلى أربعة بقع في مواقع مختلفة على وسادة agarose. تغطية لوحة agarose مع غطاء الزجاج المجهرية وإصلاحه مع البارافين الذائب لختم على الشريحة الزجاجية بدءا من الزوايا الأربع. ضع الشريحة المجهرية على المسرح مع غطاء مواجهة الهدف.
بدوره برج مكعب مرشح لتحديد مكعب eGFP وفتح مصراع مصباح الفلوريس، ثم إرسال ضوء الفلوريسين نحو العدسة من المجهر. تركيز الهدف على البكتيريا باستخدام مقبض المجهر. حدد منطقة ذات أهمية في العينة باستخدام عصا التحكم التي تتحكم في المرحلة الآلية.
إرسال مسار الانبعاثات fluorescence مرة أخرى نحو كاشف، ثم العودة إلى الوراء برج مكعب مرشح لتحديد مكعب dichroic ليزر 930 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى 20 مللي واط. تعيين حجم المنطقة ذات الأهمية إلى 30 ميكرومتر الذي يضبط الجهد تشغيل المرايا galvo ويحدد نطاق تحركاتهم. قم بتشغيل جهاز الكشف وابدأ في مسح العينة.
اختر مجال الرؤية للتصوير عن طريق نقل المرحلة بدقة من واجهة الكمبيوتر. ويمكن القيام بذلك على الإعداد عن طريق تحريك الصليب على الصورة في برنامج التحكم المجهر الذي سيحدد مركز جديد للصورة والضغط على مرحلة التحرك. وينبغي أن يحتوي حقل جيد من الرؤية للحصول على 10 إلى 30 البكتيريا غير متحركة كل في التركيز.
إذا كانت مهتمة في استخراج خلايا واحدة الفيلم-فريت البيانات, ضمان أن البكتيريا هي بشكل جيد فردي. افتح برنامج التصوير وتحقق من أن معدل عدد الفوتونات ليس مرتفعًا جدًا لتجنب تأثير تراكم يمكن أن يؤثر على القياسات مدى الحياة. إذا لزم الأمر، خفض كثافة الليزر للحفاظ على معدل العد الفوتون منخفضة.
ضبط معلمات الامتلاك بما في ذلك وقت جمع الاكتساب. اضغط على زر البدء وانتظر حتى تكتمل عملية الاستحواذ. لتحليل البيانات، افتح RStudio ثم أنشئ مشروعًا جديدًا.
إنشاء مجلد جديد في مجلد المشروع الرئيسي وتسمية البيانات، ثم نقل جميع ملفات سؤال التحليل في هذا المجلد. فتح ملف برنامج نصي جديد أو البرنامج النصي التكميلي flim_analysis.r. تثبيت حزمة FlimDiagRam مخصصة لتحليل البيانات الفيلم والدعوة إلى حزمة في مساحة العمل.
تظهر هنا وظائف التوزيع التراكمي التجريبي لمدى حياة الفلوريسنس التي تم قياسها للسلالات البكتيرية المختلفة. في حالة حدوث FRET، يتم تحويل الدالات نحو عمر أقصر. من المهم أن نلاحظ أن فريت لا يمكن أن يحدث عندما يؤدي تفاعل اثنين من البروتينات في مسافة طويلة بين الفلوروورين، والتي لا يمكن تمييزها عن عدم وجود تفاعل.
لذلك، قد يكون من الضروري تسمية البروتينات في مواقع مختلفة لتعظيم فرص التحقيق في التفاعل. بسبب الفرق الكبير في تعبيرات البروتين بين PvdA و PvdL ، فإن نفس المجمع لا يؤدي إلى بيانات FILM-FRET مماثلة. التراخيوميتريات غير المتوازنة تؤدي إلى اختلافات في مساهمة الحرة بالمقارنة مع البروتينات المقيدة التي تحمل علامة المتبرع في توزيع الفلوريسنس المسجلة مدى الحياة.
يمكن استخدام رسم الرسم التخطيطي لتوفير معلومات هامة حول قياس الرصين. في PvdA-eGFP mCherry-PvdL متحولة، كمية PvdA المسمى المانحة هي أعلى بكثير من كمية mCherry-PvdL. بين جميع الجهات المانحة الموجودة في العينة، إلا عدد قليل منهم يتفاعل مع PvdL.
واحد تاو قيمة واحدة تركزت في حوالي 2.3 نانو ثانية تشير إلى أن كل المانحين PvdA-eGFP يمكن نقل فقط مع واحد mCherry-PvdL قبول. عندما يتم عكس التسمية، من المتوقع أن تتفاعل معظم بروتينات eGFP-PvdL مع PvdA-mCherry التي تؤكدها قيم ألفا واحدة أعلى. أصبحت قيم تاو واحدة أكثر توزيعًا مما يشير إلى أن بروتينات PvdA المتعددة قد ترتبط ببروتين PvdL واحد.
أصبح إعداد FLIM متاحًا في عدد متزايد من مرافق التصوير. عينات التصوير في فيلم-فريت ليست أكثر تعقيدا من التصوير في المجهر الفيديو.
