FILM-FRET היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת לאשר אינטראקציות חשודות או חזויות של חלבון-חלבון. בפרוטוקול זה, אנו מציגים דרך לנתח נתונים במקרים מסוימים של כמויות לא מאוזנות של תורמים ומקבלים. FILM-FRET מסוגלת לספק מידע על אינטראקציות החלבון-חלבון ישירות בתאים חיים.
חשוב לחקור אינטראקציות של חלבונים אישיים בסביבה תאית מקומית, במיוחד כאשר חלבון פלואורסצנטי בא לידי ביטוי ברמה האנדוגנית. התחל על ידי גידול P.aeruginosa, E.coli TOP10, ו E.coli עוזר חיידקים כל אחד בחמישה מיליליטר של LB ללא אנטיביוטיקה ב 30 מעלות צלזיוס תוך רועד לילה. ביום שלמחר, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבויות ולערבב כמות שווה של P.aeruginosa, E.coli TOP10 ו E.coli עוזר microtube 1.5 מיליליטר.
צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 9, 300 פעמים G כדי גלולה את החיידקים, ואז להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 50 microliters של LB. צלחת נקודה של התערובת על אגר LB שחומם מראש להדגירה אותו במשך חמש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לגרד את המקום עם לולאת חיסון סטרילית ו resuspend אותו במיליליטר אחד של LB. צלחת 100 microliters של המתלה חיידקי זה על אגר LB המכיל 10 מיקרוגרם לכלוראמפניקול מיליליטר ו 30 מיקרוגרם למיליליטר ג'נטמיצין דגירה יומיים ב 37 מעלות צלזיוס לחסל חיידקי עוזר E.coli TOP10 ו E.coli. תן מושבה אחת במיליליטר אחד של LB ותדגר אותה ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות במשך ארבע שעות, ואז צנטריפוגה של הצינור במשך שלוש דקות ב 9, 300 פעמים G ולהשליך 950 microliters של על טבעי.
תן את גלולה ב 50 microliters של LB ולבודד את התערובת על LB אגר המכיל סוכרוז ולא נתרן כלורי. דגירה הצלחת לילה ב 30 מעלות צלזיוס. ספוט מושבות מבודדות על אגר LB ו LB אגר המכיל 15 מיליגרם למיליליטר ג'נטאמיצין כדי לבדוק רגישות ג'נטאמיצין.
מניחים מגלשת זכוכית מיקרוסקופ על משטח אופקי שטוח ומסדרים שתי מגלשות זכוכית ומעליהן שתי שכבות של סרט דבק סביבו. פיפטה טיפה 70 microliter של 1% נמס התעוררה על מגלשת הזכוכית ולמקום שקופית רביעית על גבי לשטח את טיפת אגרוז. לחץ למטה בעדינות במשך כדקה.
תוריד את המגלשה העליונה ותפיל כשלושה מיקרוליטרים של חיידקים בשלושה עד ארבעה מקומות במקומות שונים על כרית אגרוז. מכסים את כרית אגרוז עם כיסוי זכוכית מיקרוסקופי ולתקן אותו עם פרפין מומס כדי לאטום אותו על מגלשת הזכוכית החל מארבע הפינות. מקם את החלקת המיקרוסקופיה על הבמה כאשר המכסה פונה למטרה.
סובב את צריח קוביית המסנן כדי לבחור את קוביית eGFP ולפתוח את תריס מנורת הפלואורסצנטיות, ולאחר מכן שלח את אור הפלואורסצנטי לכיוון העינית של המיקרוסקופ. מקד את המטרה על החיידקים באמצעות ידית המיקרוסקופ. בחר אזור מעניין בדגימה באמצעות מוט ההיגוי השולט בשלב ממונע.
שלח את נתיב פליטת הפלואורסצנטיות בחזרה לכיוון הגלאי, ולאחר מכן להחזיר את צריח קוביית המסנן כדי לבחור את קוביית dichroic עבור לייזר 930 ננומטר ולהגדיר את כוח הלייזר ל 20 מילי וואט. הגדר את גודל אזור העניין ל- 30 מיקרומטרים אשר מתאים את המתח המפעיל את מראות הגלבו ומגדיר את טווח תנועותיהם. הפעל את הגלאי ולהתחיל לסרוק את הדגימה.
בחר את שדה התצוגה להדמיה על-ידי הזזה עדין של השלב מממשק המחשב. זה יכול להיעשות על ההתקנה על ידי הזזת הצלב על התמונה בתוכנת בקרת מיקרוסקופ אשר יגדיר את המרכז החדש של התמונה ולחיצה על שלב ההזזה. שדה מבט טוב לרכישה צריך להכיל 10 עד 30 חיידקים ללא תנועה כולם בפוקוס.
אם אתם מעוניינים לחלץ נתוני FILM-FRET של תאים בודדים, ודאו שהחיידקים מותאמים היטב. פתח את תוכנת ההדמיה ובדוק שקצב ספירת הפוטונים אינו גבוה מדי כדי למנוע אפקט ערימה שיכול להשפיע על מדידות לכל החיים. במידת הצורך, הנמיך את עוצמת הלייזר כדי לשמור על שיעור ספירת הפוטון נמוך.
התאם פרמטרי רכישה כולל זמן איסוף הרכש. לחץ על לחצן התחל והמתן להשלמת הרכישה. כדי לנתח את הנתונים, פתח את RStudio וצור פרוייקט חדש.
צור תיקיה חדשה בתיקיה הראשית של הפרוייקט ותן לה שם לנתונים ולאחר מכן העבר את כל הניתוחים שאל קבצים לתיקיה זו. פתח קובץ Script חדש או את קובץ ה- Script flim_analysis.r. התקן את חבילת FlimDiagRam הייעודית לניתוח נתוני סרטים והתקשר לחבילה בסביבת העבודה.
פונקציות התפלגות מצטברות אמפיריות של אורך החיים הפלואורסצנטי הנמדד עבור זנים חיידקיים שונים מוצגים כאן. אם FRET מתרחשת, הפונקציות מועברות לכיוון אורך החיים הקצר יותר. חשוב לציין כי FRET לא יכול להתרחש כאשר האינטראקציה של שני החלבונים גורמת למרחקים ארוכים בין שני flurophores, אשר לא ניתן להבדיל בין היעדר אינטראקציה.
לכן, ייתכן שיהיה צורך לתייג את החלבונים בעמדות שונות כדי למקסם את הסיכויים של חיתוח האינטראקציה. בשל ההבדל הגדול בביטויי חלבון בין PvdA ל- PvdL, אותו קומפלקס אינו יוצר נתוני FILM-FRET דומים. סטויצ'יומטריות לא מאוזנות מובילות להבדלים בתרומתם של החופשיים בהשוואה לחלבונים המאוגדים המסומן על ידי תורמים בהפצה המתועדת של חיי הפלואורסצנטיות.
ניתן להשתמש בעלילה של הדיאגרמה כדי לספק מידע קריטי אודות הסטוצ'יומטריה. במוטנט PvdA-eGFP mCherry-PvdL, כמות PvdA המסומן על-ידי התורם גבוהה בהרבה מכמות mCherry-PvdL. בין כל התורמים הקיימים בדגימה, רק מעטים מהם מקיימים אינטראקציה עם PvdL.
ערך טאו יחיד אחד מרוכז בערך 2.3 ננו שניות מרמז כי כל תורם PvdA-eGFP יכול להעביר רק עם מקבל mCherry-PvdL אחד. כאשר התיוג הוא הפוך, רוב החלבונים eGFP-PvdL צפויים לקיים אינטראקציה עם PvdA-mCherry אשר מאושר על ידי ערכי אלפא אחד גבוה יותר. ערכי טאו אחד הפך מופץ יותר מציע כי חלבוני PvdA מרובים עשויים להיקשר חלבון PvdL יחיד.
ההתקנה FLIM הופך להיות זמין במספר גדל והולך של מתקני הדמיה. דגימות הדמיה ב- FILM-FRET אינן מסובכות יותר מהדמיה במיקרוסקופיית וידאו.
