Este protocolo utiliza um método reciclável e modificado na produção de compostos espirocíclicos. O ensaio MTT ajuda a responder à questão relativa à citotoxicidade dessas novas moléculas. Esta técnica produz novas moléculas modificáveis usando um material de partida regenerador.
O ensaio MTT fornece resultados biológicos relativamente rápidos e fáceis de analisar Comece realizando a síntese de fase sólida dos heterociclos espirocíclicos seis e sete, como demonstrado anteriormente. Prepare 20 mililitros de uma solução de MTT de cinco miligramas por mililitro usando PBS estéril como diluente. Filtrar e conservar a solução a menos 20 graus Celsius.
Em seguida, prepare uma diluição um-para-um da solução de MTT em DMEM. Preparar um mililitro cada de soluções-estoque em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro de compostos de teste em DMSO. Armazene-os a menos 20 graus Celsius.
Preparar 200 microlitros por dose das soluções de trabalho dos compostos de ensaio, diluindo as concentrações de reserva. Um a 1000 em meio livre de soro. Nas sementes de cultura de tecidos, sete células de COS em meio completo em cultura de tecido de fundo plano trataram 96 placas de poço a uma concentração de 4.000 células por 200 microlitros por poço.
Usando um pipeter multicanal. Incubar as células durante 24 horas a 37 graus Celsius numa atmosfera contendo 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, aspirar o sobrenadante dos poços usando uma pipeta de pastagem de vidro presa a uma bomba de vácuo.
Dosar as células em triplicado com os compostos de ensaio utilizando as soluções de trabalho previamente preparadas. Em seguida, devolva as células à incubadora. Após 24 horas, aspirar o sobrenadante dos poços e adicionar 200 microlitros de solução de MTT a cada poço.
Incube a placa por quatro horas. Aspirar suavemente o sobrenadante dos poços sem perturbar os cristais formazanos roxos. Adicione 200 microlitros de DMSO a cada poço para dissolver os cristais.
Em seguida, incube a placa à temperatura ambiente por 15 minutos. Meça a absorvância para cada poço a 590 ou 600 nanômetros usando um leitor de placas de 96 poços. Use poços sem células como pano de fundo e faça a média do valor de absorvência.
As costuras espirocíclicas de gox seis e sete foram sintetizadas usando um protocolo modificado. O progresso da reação foi monitorado pela detecção do desaparecimento da Esther alfa beta insaturada usando espectroscopia de infravermelho. O ensaio de MTT foi utilizado para determinar a viabilidade celular.
A cisplatina, que é conhecida por induzir a morte celular em altas concentrações, serviu como um controle positivo. Como esperado, quanto maior a concentração de cisplatina, menor é a viabilidade celular. O ensaio de MTT foi então utilizado para testar os compostos espirocíclicos seis e sete e a furfurilamina.
A furfurilamina e a spirocíclica gox seam six apresentaram citotoxicidade semelhante. No entanto, a toxicidade do composto espirocíclico sete foi visivelmente maior do que a da furfurilamina e seis. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a N-alquilação realizada usando haletos de acila volumosos foi encontrada para reduzir a taxa de eliminação beta, reduzindo assim o rendimento do produto.
