Este protocolo pode ajudar os envolvidos na comunidade de melancia a avaliar o patógeno do fusarium wilt, e isso ajudará a determinar as populações de patógenos que estão presentes e ajudar a gerenciá-lo de forma eficaz. O murmúrio de fusarium de digitação racial é complexo e demorado para ser concluído, e ter três opções viáveis de bioensa de digitação de raça permitirá que os usuários escolham um método mais adequado para suas condições experimentais. Todos os três métodos ajudam os profissionais de saúde vegetal a diagnosticar a gravidade potencial das infecções por murcho de fusarium relacionados a um isolado específico.
Essas informações permitem decisões integradas de gestão de doenças informadas e eficazes. Para iniciar a preparação para o plantio, encha as células 8x16 iniciando apartamentos com meio de plantio enquanto bate para comprimir o solo. Em seguida, semeie sementes com seu ápice apontando para cima para uma profundidade igual ao seu comprimento.
Depois que as sementes são semeadas, cubra o meio contendo as sementes enterradas com a terra de Fuller a uma profundidade de 0,3175 a 0,635 centímetros, e, em seguida, misture os apartamentos para umedecer o meio sem criar água em pé ou de agrupamento. Depois, mantenha o meio úmido por neblina por 20 segundos a cada 180 minutos durante cinco dias até a germinação das sementes. Depois da germinação, rega os apartamentos uma vez por dia.
Cinco dias após o plantio, coloque discos de papel infiltrados de 1 a 1,25 centímetro de diâmetro contendo o isolado de fusarium oxysporum preferido em um grão de suco V8 clarificado e 1/4 de 1/4 de 1/4 de 1/4 de 100 de ágar de batata, ou placa de mídia QPDA, para armazená-los em uma incubadora a 28 graus Celsius por oito dias. No oitavo dia, transfira as placas V8 e QPDA para um armário de biossegurança antes de desalojar conidia raspando um espalhador de células estéreis pela superfície média e acumule a suspensão de conidia líquida a um tubo de cultura estéril de 50 mililitros. Em seguida, quantifique a contagem de esporos e prepare a solução final inóculo transferindo o volume calculado de cerca de 1 milhão de esporos para o tubo de cultura estéril fresco elevando o volume total para 30 mililitros com água deionizada estéril.
Para se preparar para a inoculação, coloque apartamentos de isopor de células 6x12 previamente higienizados com alvejante de 10% e bem enxaguados para receber as plantas inoculadas. Várias horas antes da inoculação, rega minuciosamente as plantas. Duas horas após a rega, remova as plantações dos apartamentos de isopor de células 8x16 e enxágue suas raízes.
Em seguida, armazene temporariamente as plantas enxaguadas em recipientes limpos com água da torneira até o uso, mantendo as cultivares separadas umas das outras. Mais tarde, separe as plantas em grupos de seis indivíduos e mantenha os grupos de mudas envoltos em toalhas de papel molhadas em uma bandeja de laboratório. Coloque de 25 a 30 centímetros cúbicos de solo no fundo de cada célula da bandeja de isopor 6x12 e use uma garrafa de esguicho para molhar o solo até ficar visivelmente úmido.
Começando pelo controle saudável, coloque um grupo das seis mudas intactas da mesma cultivar nos tubos de 50 mililitros contendo o inóculo. Para inocular, vórtice os tubos de plantatas com raízes submersas por 30 segundos. Em seguida, coloque uma única planta por célula nos apartamentos de isopor 6x12 com as plantas da mesma cultivar em uma coluna da bandeja.
Cubra as plantas com meio de plantio e coloque delicadamente. Use uma seringa para molhar a planta com 20 mililitros de água, evitando espirrar. Quando todas as plantações tiverem sido replantadas, coloque as plantações durante a noite em um ambiente escuro fechado com uma temperatura média de 27 graus Celsius.
Para infestar os grãos, prepare o inóculo isolando e culminando uma cepa de nésporum de fusarium oxysporum em um prato de QPDA a ponto de seu crescimento cobrir metade da placa. Prepare os grãos adicionando água da torneira estéril aos frascos de vidro Erlenmeyer de um litro contendo 200 gramas de grãos para cobrir completamente os grãos até pelo menos cinco centímetros. Depois de encharcar os grãos nos frascos a 24 graus Celsius por duas horas, escorra a água do frasco e tampe a abertura do frasco com um pedaço de rolo de algodão embrulhado em pano de queijo antes de cobrir a abertura com envoltório de papel alumínio.
Esterilize os frascos na autoclave em um ciclo de gravidade por uma hora com cinco minutos de secagem, em seguida, deixe os frascos esfriarem até a temperatura ambiente. Transfira os grãos para um saco de cultivo de cogumelos com um filtro. Retire o ar do saco e dobre o excesso de plástico ao redor dele.
Coloque o saco em uma caixa de plástico autoclave-segura e cubra a lixeira com envoltório de papel alumínio, em seguida, autoclave novamente usando as mesmas configurações de antes. Após a autoclavagem, deixe o fungo incubar os grãos na bolsa por três semanas. Use um furo de cortiça estéril de tamanho número quatro para cortar discos de ágar de seis milímetros de diâmetro da zona de crescimento ativo na placa de cultura.
Desdobre o saco para colocar cinco discos de ágar com uma técnica estrita estéril. Use um cilindro graduado de 50 mililitros estéril para medir e adicionar 35 mililitros de água estéril da torneira ao saco. Encha um pote de plástico com uma mistura de vasos e, em seguida, adicione a quantidade medida de mistura de vasos em um grande saco plástico contendo 14 grãos de grãos infestados.
Crie uma almofada de ar no saco e sele-a fechada antes de misturar os grãos e o solo invertendo o saco várias vezes. Uma vez feito, encha uma panela esterilizada pela superfície com a mistura de solo infestada. Repita o processo para cada variedade remanescente de melancia para um total de quatro potes cheios de solo infestado por isolação sendo testado.
Em seguida, semear seis sementes de melancia na panela com o ápice da semente virada para cima. Usando uma garrafa de spray, molhe a parte superior de 0,3 a 0,6 centímetros de solo com água e, em seguida, coloque um prato de plástico transparente sob e sobre cada panela. Encha 48 pastilhas celulares com areia pasteurizada a vapor, turfa, vermiculite na proporção 4:1:1 e bata nas pastilhas para comprimir o solo.
Em seguida, coloque as pastilhas em bandejas de plástico e semeie as sementes como explicado anteriormente. Sete dias antes do plantio, inocular cinco placas QPDA com papel infiltrado para armazená-las em uma área incubada por oito dias em um ciclo escuro de 14 horas/10 horas. No sétimo dia, transfira dois ágars de um centímetro quadrados em cada frasco erlenmeyer de 250 mililitros contendo 100 mililitros de dextrose de batata e coloque os frascos de Erlenmeyer em um shaker de bancada.
No dia da inoculação, colve os esporos filtrando o inóculo através de quatro camadas de pano de queijo estéril para determinar a concentração micro-conidial do frasco. 14 dias após a semeadura, transfira as pastilhas celulares com as mudas para a bandeja de teias e, em seguida, coloque a bandeja com as mudas em uma banheira de plástico contendo os sete litros de suspensão inóculo. Após 15 minutos mantendo o inóculo intacto, transfira as pastilhas celulares contendo as mudas inoculadas em bandejas sem buracos e coloque as bandejas sem buraco no banco da estufa, seguidas de rega conforme necessário.
Mantenha a iluminação e as condições ambientais como descrito anteriormente para o bioensaio do mergulho radicular. Dependendo do método utilizado, inicie a classificação observando e calculando a incidência de murchar e plantar e tirar imagens digitais para documentar o progresso da doença. No método modificado de mergulho na bandeja, as cultivares Black Diamond e Charleston Gray infectadas com um isolado da raça 2 apresentaram sintomas graves e morreram.
Em contraste, a cultivar Citrullus amarus PI mostrou resistência. No método de mergulho radicular, as mudas infectadas com um isolado de raça 0 sobreviveram principalmente, enquanto quase todas as mudas infectadas com um isolado da raça-3 morreram. No método infestado de grãos, as cultivares Sugar Baby e Charleston Gray cultivadas em solo infestado de raça 2 começaram a murchar e morrer, enquanto as plantas Citrullus amarus PI ainda parecem saudáveis.
Lembre-se de semear e manter as plantas adequadamente, verificar o patogóico isolar para viabilidade, entender as técnicas únicas de cada método de inoculação e ser consistente ao avaliar sintomas da doença. Com os resultados desses métodos, os pesquisadores podem investigar os determinantes genéticos subjacentes que regem a expressão de variância diferencial entre os isolados por meio de sequenciamento e análise genômica comparativa. Usando esses métodos, os pesquisadores têm sido capazes de avaliar a prevalência de diferentes fenótipos de virulência em diferentes locais e comparar esses fenótipos com elementos genéticos observáveis.
