Este método ajudará a ilustrar mecanismos moleculares de fenômenos biológicos multifacetados. Como a mecanobiologia, a eletrofisiologia óptica e a imagem de proteína de DNA/RNA de super-resolução usando técnicas automáticas de imagem de células vivas. Este protocolo permite a correção automática, multifuncional, de alta throughput, auto-deriva e aquisição de imagens a longo prazo.
É compatível com a maioria das plataformas microscópicas fluorescentes, como a NYCOM. Quem tentar essa técnica pela primeira vez deve entender a função de cada passo, em vez de apenas seguir o protocolo estritamente, para garantir um experimento bem sucedido. Comece colocando a câmara ambiental no estágio motorizado do microscópio invertido.
Ajuste a vazão de CO2 para 160 mililitros por minuto e ajuste a temperatura da câmara. Em seguida, adicione 40 mililitros de água purificada no banho da câmara. Retire a placa de Petri com células da incubadora e coloque-a na câmara do ambiente.
Ligue o controlador confocal e o microscópio invertido. Mude o caminho da luz para a direita. Observe as células anexadas usando Micro Manager.
Se células suficientes tiverem sido anexadas ao gel, transfira a placa de Petri de volta para a incubadora. Caso não, continue a incubação celular por mais 30 minutos para B2B, e 60 minutos para câncer de pulmão ou células PC-9. Corte 2 pequenos pedaços de fita adesiva e coloque-os na câmara ao redor do orifício circular.
Em seguida, aplique um pouco de cola adesiva na área da fita que a placa de Petri cobrirá. Tire a placa de Petri da incubadora. Coloque lentamente a placa de Petri na câmara e deixe o fundo da placa fazer contato com a cola.
Pressione a tampa da placa de Petri por 1 minuto para permitir que a cola faça contato total com a placa de Petri e solidifique. Empurre suavemente a placa de Petri horizontalmente para garantir que a cola se solidificou e que a placa de Petri não se mova. Em seguida, feche a tampa da câmara.
Abra o IntelliJ e defina um parâmetro T1 na linha 93 do arquivo elements_script.java. Certifique-se de que esse valor é maior do que o tempo de execução da macro e elementos usados para imagens confocal de um campo de visão. Clique no botão Executar para iniciar o projeto AMFIP IntelliJ.
Clique no botão ao vivo e multi-desaquisição na interface principal do Micro Manager e, em seguida, alterne o caminho de luz do microscópio invertido para a direita para imagens de campo brilhante. Mude para o objetivo de 10 vezes e abra a luz LED com a intensidade definida em 5%Clique no objetivo do microscópio de caminho de luz e botão de lâmpada LED no painel TI2 elementos. Ajuste o joystick XY e o botão do plano Z para encontrar a posição correta e o plano de foco em ajuste do gel na placa de Petri.
Use o objetivo de 10 vezes para encontrar os campos de visão apropriados de múltiplas células únicas ligadas ao gel. Verifique as várias posições caixa XY na janela de aquisição multidimensional. Clique no botão lista de posição de edição e observe a janela da lista de posição do estágio que aparece.
Altere o objetivo para 40 vezes, aumente a intensidade da luz LED para 15% Reajuste o estágio motorizado XY para localizar os campos de exibição e registrar as coordenadas clicando no botão de marcação na janela da lista de posição do palco. Recorde de 6 a 7 campos de visão desejados. Clique no botão salvar como botão na janela da lista de posição do palco para gravar as coordenadas e inserir O T1 como a seção de intervalo de tempo da aquisição de imagens para T1 na seção de ponto de tempo na janela de aquisição multidimensional.
Abra elementos, altere o caminho da luz para a direita para imagens confocal e desligue a luz LED. Em seguida, clique no botão remover o bloqueio e ligue o canal laser FITC para imagens YAP verificando a caixa FITC. Depois de ajustar a velocidade de varredura para 1 quadro por 2 segundos, gire o botão do plano Z para encontrar a posição Z das células anexadas rapidamente.
Regisso dos limites inferior e superior para a pilha Z. Clique em macro na fita superior, selecione editor de macro no menu suspenso de macro e insira os limites inferiores e superiores para a pilha Z em um arquivo macro. Ligue o canal laser DAPI para imagens de contas verificando a caixa DAPI para encontrar e registrar a posição Z focada das contas.
Vá para o editor de macro e insira os valores registrados no arquivo macro. Para definir a tarefa de mover o estágio motorizado usando o AMFIP, vá para Micro Manager, clique em automação plug-ins para abrir a interface gráfica de usuário do AMFIP. Em seguida, clique em adicionar ponto ou remover botões de ponto para adquirir o número exato de campos de exibição selecionados.
Insira as coordenadas gravadas dos campos de visão no painel de coordenadas. Defina o tempo total de experiência no campo total de texto de tempo de experiência. Clique no botão de configuração de tempo adicional e defina o intervalo de tempo T2 de mover o estágio motorizado para cada FOV.
Maximize o tamanho da janela dos elementos e arraste a GUI de AMFIP para o lado direito da tela para evitar que a GUI perturna as operações automáticas do cursor e clique no botão de digitar. Depois que a primeira macro terminar. clique no botão de aquisição na janela de aquisição multidimensional.
Depois de terminar a imagem de longo prazo, pare a tarefa AMFIP clicando no botão de pausa na janela de plug-in de automação e no botão stop na janela de aquisição multidimensional. Abra elementos e defina imagens de pilha Z clicando nos botões superior e inferior na janela de aquisição ND. Mude o caminho da luz para a direita e abra a luz LED.
Retire lentamente e cuidadosamente as tampas da câmara e da placa de Petri enquanto monitora a visão de campo brilhante para qualquer deriva do campo de visão. Use uma pipeta de plástico para pegar 0,5 mililitros de solução SDS. Segure cuidadosamente a pipeta de plástico um pouco acima do meio de cultura na placa de Petri e adicione 1 a 2 gotículas da solução SDS no meio da cultura.
Uma vez que as células e a visão de campo brilhante sejam dissolvidas, feche a luz LED, mude o caminho da luz para a esquerda, clique no botão remover intertravamento. Execute a imagem da pilha Z e salve a pilha de imagens como reference_N, onde N é o número de sequência de cada campo de exibição. Clique no botão XY de várias posições na janela de aquisição multidimensional.
Em seguida, selecione o próximo campo de exibição e clique no botão go-to para mover o estágio motorizado para o segundo FOV. Repita esta etapa para cada campo de visão. A localização nuclear é de proteína associada a sim ou YAP em ells B2B aumentado com o aumento da rigidez do substrato, enquanto as células PC-9 mostraram concentração yap semelhante no núcleo e citoplasma em substratos de rigidez variada.
A célula B2B aumentou monotonicamente a área de disseminação ao longo do tempo, juntamente com uma diminuição na relação nuclear yap para citoplasmica, enquanto a célula PC-9 manteve uma área de propagação celular relativamente imutável, orientação e razão nuclear YAP para citoplasmática durante o processo de disseminação de 10 horas. Durante a duração de 10 horas da propagação precoce, a célula B2B representativa deformou constitutivamente a superfície do substrato e aplicou tempo evoluindo a tração celular em toda a área celular. Em contraste, a célula PC-9 representativa só desenvolveu deslocamento e tração nas 2 extremidades do corpo celular, e sua tração diminuiu após 7,5 horas.
A relação nuclear yap para citoplasmica e tração dipolo de células B2B pareciam seguir duas tendências distintas, sugerindo que poderia ter havido dois grupos de células B2B que coexistiram no experimento. No primeiro grupo, a relação nuclear-citoplasmica yap e tração dipolo aumentou junto com o alargamento da área de propagação celular e atingiu sua máxima em aproximadamente 1.000 micrômetros quadrados. No segundo grupo, a relação nuclear-citoplasmica e a tração do dipolo aumentaram a uma taxa mais lenta com o alargamento da área de propagação celular e mantiveram valores quase constantes quando a área de propagação celular continuou a aumentar.
As faixas de pilha Z para todos os canais laser precisam ser determinadas cuidadosamente para superar a deriva potencial do campo de visão durante o movimento do palco em imagens de longo prazo. Esta nova técnica permite imagens automáticas, não invasivas a longo prazo e multiposição, e pode ajudar a elucidar mecanismo de biologia molecular que requer rastreamento temporal e espacial de células e organelas.
