O que introduzimos hoje é um método simplificado modificado e cirurgicamente eficiente, para estabelecer isquemia de membros traseiros em camundongos ApoE. Este método pode ser implementado em qualquer instalação animal. A principal vantagem do método sinovial é uma baixa invasividade, utilizando uma incisão de menos de cinco milímetros.
O método tem um aprendizado. Por isso, aconselhamos a prática em modelos microcirúrgicos antes de trabalhar nos animais, que serão incluídos na análise final. O método será demonstrado por Kaixuan Yan, um médico de medicina e o aluno do meu laboratório.
Comece preparando os equipamentos e ferramentas necessários para a cirurgia. Depois de administrar a anestesia ao camundongo, aplique essa pomada nos olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do núcleo a aproximadamente 37 graus Celsius.
Usando um cotonete e creme de depilação, remova cuidadosamente o cabelo da pele do membro traseiro do lado direito. Coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento sob um microscópio dissecando. Use álcool para desinfetar a pele e limpar com o algodão longe do lado vegetal da incisão.
O uso de fórceps pontiagudas e tesouras cirúrgicas fazem uma incisão de aproximadamente três a quatro milímetros no meio da região inguinal. Remova cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo com a ajuda de fórceps pontiagudas finos para expor o feixe neurovascular femoral proximal. Usando um cotonete umedecido com soro fisiológico, mova cuidadosamente a artéria femoral para longe do nervo femoral e da veia femoral.
Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure cuidadosamente a membrana da baia femoral. Em seguida, passe para suturas absorvíveis de 7-0 através da artéria femoral proximal e faça nós duplos usando a tesoura de molas. Depois transecte a artéria femoral entre os dois laços.
Passe a sutura absorvível 6-0 através da borda inferior da incisão e arraste suavemente a incisão para a região do lado direito do joelho do membro traseiro para expor a artéria femoral distal. Mova cuidadosamente o tecido subcutâneo para expor o feixe neurovascular. Disseque a artéria femoral da veia femoral e do nervo femoral, e use algodão para proteger o nervo.
Em seguida, usando a ponta de uma sutura 7.0, fure a membrana da baia femoral. Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da artéria femoral distal e faça nós duplos usando a tesoura de mola para transstoar a artéria femoral entre dois laços. Depois, costure a incisão usando as suturas absorvíveis 6-0.
Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa e continue monitorando seus parâmetros vitais até a recuperação. Determine o sucesso da dupla ligadura da artéria femoral ou DLFA no dia seguinte via ressonância magnética. Antes do procedimento de DLFA, os pesos dos camundongos variavam de 29,6 a 38,0 gramas.
Sete dias após a cirurgia de DLFA, os pesos variaram de 26,5 a 34,1 gramas, significativamente inferiores aos pesos pré-DLFA. As regiões proximais e distais da FA direita não apresentaram perfusão. Os resultados da escala tarlov foram significativamente diminuídos um dia após a cirurgia.
Embora tenham aumentado lentamente nos dias seguintes, eles ainda estavam abaixo da linha de base até o sétimo dia. As patas dos membros traseiros isquêmicos em sete camundongos não foram capazes de esticar naturalmente em comparação com o lado contralateral. Além disso, quatro dos camundongos apresentaram leve descoloração das patas em comparação com o lado contralateral.
A coloração de H&E do músculo GM direito revelou miofibers que exibiam necrose isquêmica irregular, onde células satélites proliferantes haviam substituído os miofibers necrosados e foram distribuídos em massa ou com dispersão regular. Myofibers exibindo infiltração inflamatória por macrófagos multinucleados perderam suas características morfológicas normais, com muito poucos miofibers regenerados presentes. Seções transversais desses myofibers regenerados eram redondas.
O citoplasma estava manchado de vermelho e um pequeno núcleo ou múltiplos núcleos estavam localizados no centro. No entanto, esse tipo de padrão inflamatório não foi observado no GM esquerdo. A coloração de anticorpos CD31 realizada para observar a densidade microvascular indicou que os membros traseiros isquêmicos apresentaram significativamente mais densidade microvascular do que o lado não isquêmico. O mais importante é a dissecção da artéria femoral.
O operador precisa ser experimentado em técnicas microcirúrgicas, bem como estar familiarizado com a anatomia do javal do rato. Em princípio, este método também poderia ser usado para estudar lesão isquemia-reperfusão na perna. Por meio deste, a artéria pode ser ocluída com um grampo de vaso macio antes de permitir a reperfusão.
