Os autores agradecem a NSF (MCB-1157876) para o financiamento. Agradecemos também a Alberto Civetta, John Roote e dois revisores anônimos por seus comentários.

Experimentos em pequena escala deve ser realizada para se familiarizar com todo o processo. 1. Coleta de fêmeas e machos virgens Naïve A versão mais simples do experimento descrito é composto por quatro tipos de cruzamentos iniciais, que envolvem a seguinte combinação de adultos: a) w 1.118 indivíduos, a fim de coletar fêmeas virgens, b) Oregon-R indivíduos, a fim de recolher os machos de referência ingênuos, c ) P {sw} machos homozigotos e fêmeas virgens de uma linha de controle que leva a organização do tipo selvagem de Sdic a fim de recolher os machos experimentais ingênuos (Tipo I), ed) P {sw} machos homozigotos e Sdic-sw-exclusão de transporte de fêmeas virgens a fim de recolher os machos experimentais ingênuos que levam a deficiência Sdic-sw (Tipo II). <ol><li> Configurar vários frascos contendo 8-10 fêmeas e 5 machos cada. Permitir que as mulheres para colocarovos e transferir os adultos a novos frascos a cada 3-5 dias. Use garrafas em vez de frascos, se necessário e use sempre alimentos frescos. O número de ampolas requeridas dependerão do número de tipos de machos experimentais em estudo e o número de indivíduos considerados necessários para detectar diferenças (Tabela 1). Mais de 10 fêmeas por frasco pode resultar em excesso de população durante o crescimento das larvas, o que pode provocar variações na fertilidade da progenitura. Guardar os frascos a 25 ° C numa câmara de temperatura controlada. </li><li> Iniciar a coleta de fêmeas e machos virgens ingênuas nos dias 11 º e 12 º depois de configurar as cruzes iniciais. O período de espera varia em função da temperatura; menores temperaturas resultam em maior tempo de retardamento do desenvolvimento do conjunto de indivíduos. Outro fator que afeta o momento de eclosão é o tipo de meio. Alimentos nutritivos, como meio de fubá, o fermento 29, garante o bom desenvolvimento do adultosistema reprodutivo, o que facilita o acasalamento. Colete unmated voa cada 4-6 horas. Ao coletar, anestesiar moscas através da introdução de CO 2 para dentro do frasco, toque as moscas para baixo, e sexo-los sob microscópio estereoscópico (Figura 2). Coloque as moscas desejados em diferentes frascos por sexo e fenótipo e rotular os frascos adequadamente. </li></ol> Nota 1. Rotina de coleta começa pela manhã, descartando os adultos que surgiram durante a noite anterior. Recolhe fêmeas e machos virgens naive uma ou duas vezes durante o dia. Tipicamente, D. melanogaster os machos tornam-se sexualmente maduros 8 horas após a eclosão a 25 ° C 30. Se as moscas são mantidas sob 12:12 h de luz / escuridão ciclos, espera-se dois picos de eclosão: durante o primeiro 1-2 horas após a luz é acesa, e durante a 2 horas antes que a luz é desligada. Eclosão ocorre dentro de 24 horas após o escurece pupa. Nota 2. Não mais do que 10 fêmeas should ser colocado no mesmo frasco para evitar a superlotação. Isso também limita a perda de fêmeas no caso de terem de ser descartadas por pelo menos um deles não é virgem. Nota 3. A fim de recolher o número apropriado de fêmeas e machos virgens ingênuas em um curto período de tempo, as seguintes medidas podem ser adotadas. Configure 15-20 frascos de w 1118 para experimentos envolvendo dois tipos de homens experimentais (Tabela 1). Polvilhe levemente a superfície da mídia e adicionar algumas pelotas de fermento biológico seco para facilitar a oviposição. Transfira os pais, pelo menos quatro vezes em dias consecutivos. Para aumentar a superfície disponível para a fase de pupa em cada frasco, inserir papel multi-dobrada (7 x 5 cm) durante o 4 º ou 5 º dia após os pais são transferidos para um outro frasco (Figura 3). Se o número de adultos emergidos a partir do cruzamento inicial não é suficiente, espere mais alguns dias e recolher indivíduosals de frascos criado em datas diferentes. Plano para realizar os experimentos ao longo de vários dias consecutivos para igualar a carga de trabalho. 2. Experimentos Double-acasalamento A Figura 4 mostra os principais passos envolvidos nas experiências de dupla acoplamento realizadas em 14. <ol><li> Na manhã do dia 1, criou o primeiro acasalamento. Os machos Oregon-R são os primeiros a acasalar no ensaio ofensa. <ol><li> Usando o aspirador, configurar frascos contendo outubro 4-05 dias de idade, de olhos brancos w fêmeas virgens 1118 e 10 de olhos vermelhos Oregon-R machos virgens de cada um. Duas a três frascos são criados por dia durante 5 dias consecutivos. O número de frascos a ser configurado pode variar, dependendo do número de indivíduos disponíveis. Permitir que as moscas se acasalar por 2 horas. </li><li> Descartar Oregon-R machos e fêmeas em cada lugar um novo frasco utilizando um aspirador (Figura 5). Identificação de sexo pode ser conseguida por meio de inspecção visual de algunsdiferenças morfológicas (Figura 2). Rotular cada frasco adequadamente e deixar a mulher no frasco por 2 dias (doravante &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> No dia 3, configure o segundo acasalamento. Selecção dos machos e transversais definidos, deve ser realizado de forma aleatória, de modo a minimizar qualquer tendência potencial para qualquer um dos tipos de machos experimentais. <ol><li> Duas horas antes da luz é desligada, transferir novamente a fêmea em um novo frasco com um aspirador. Rotular o novo frasco adequadamente (a seguir &quot;v2&quot;). </li><li> Introduzir três machos experimentais 5-6 dia de idade do mesmo genótipo em V2. </li><li> Repita 2.2.1 e 2.2.2 para cada fêmea. </li><li> No dia 4, duas horas antes direito a luz é ligado (ou seja, não mais do que 12 horas após a 2.2.1), descarte homens usando o aspirador. </li></ol></li><li> No dia 6, transferir cada fêmea novamente em um novo frasco. Rotular os novos frascos de forma adequada (a seguir &quot;v3&quot;). </li><li> No dia 10, descartar a 1118 w </sup&gt; fêmeas. </li><li> Examine as progênies em v2 e v3. A primeira inspecção é realizada após 13-15 dias após a fêmea é introduzida V2 (ou V3), por exemplo, no dia 17 após a primeira ovipositar começou fêmea em V2. A segunda inspeção é realizada exatamente após 17 dias. Este período de tempo representa um limite temporal, superior de segurança, que garante não de segunda geração no mesmo frasco. Duas inspecções evitar a superlotação, facilitando a contagem de progênie. <ol><li> No Dia 17, v1 inspecionar e garantir que não são descendentes de olhos vermelhos presente, se não marcar o frasco adequadamente. Presença de progenitura de olhos em branco indicam que a mulher não era virgem no momento do acoplamento inicial, enquanto nenhuma progénie indica que o acasalamento com o de referência ou os machos experimentais não ocorrem. </li><li> No dia 17, realizar a primeira inspeção de v2. Anesthetize surgiu progênie em v2 com CO 2 e classificá-los por cor dos olhos e sexo. Números recordes de progênie filhas de primeiro e segundoond homens. Figura 6 mostra os fenótipos esperados na progênie de cada esquema de acasalamento. Nesta experiência em particular 14, apenas a descendência feminina pode ser atribuído inequivocamente como desejado pela referência ou os machos experimentais e, portanto, apenas a informação de filhas podem ser usados ​​para calcular P 2. Se com outros marcadores a paternidade de descendência masculina pode ser atribuído inequivocamente, progenitura contagens de ambos os sexos, pode ser usado nos cálculos a jusante. Descarte a descendência, mas manter v2 para segunda inspecção. </li><li> No dia 20, proceder como no 2.5.2 com a prole recém-surgido em v2 e, em seguida, descartar o frasco. </li><li> No dia 20, inspecionar a descendência surgiu em v3 pela primeira vez e siga o passo 2.5.2. </li><li> No dia 23, proceder como no 2.5.3 com a prole recém-surgido em v3. </li></ol></li></ol> Nota 1: Devido ao efeito de inflar potencial na pontuação P que a poligamia pode ter (2.2.2 e 2.2.3), o acasalamentopode ser limitado a um determinado período de tempo. O período de tempo dependerá da frequência remating relacionado com o genótipo do sexo feminino e masculino usados. A probabilidade de acoplamento múltiplo é especialmente reduzido durante o período nocturno 11. Nota 2: Não adicione pelotas leveduras vivas, porque isso pode causar problemas devido ao potencial de crescimento excessivo da levedura quando o número de moscas adultas é baixo. 3. Análise de Dados <ol><li> Contagem de progênie gravadas devem ser organizados de forma adequada para a inspeção visual e fácil análise eficiente, com um pacote estatístico adequado (por exemplo, JMP da SAS Institute) ou ferramentas baseadas em web livre (eg <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacidade competitiva do esperma. Adicionar contagens de v2 e v3. Moscas fêmeas que deram origem a nenhum ou muito limitada progênie (por exemplo, &lt;10), morreu durante o procedimento, ou estavam apenas com êxito inseminaçãoted por um dos dois machos são considerados como não informativo e são excluídos de qualquer análise estatística jusante (2.5.1 e na Tabela 2). Calcular a pontuação P 2 para cada fêmea informativo. </li><li> Testar se existem diferenças estatisticamente significativas nos valores de P 2 entre os machos experimentais comparados. Isso pode ser feito usando paramétrico (HSD de Tukey, por exemplo) ou testes não paramétricos (por exemplo, aço-Dwass) dependendo de vários fatores, incluindo a assimetria da distribuição dos valores de P 2 ea dependência entre a variância ea média. A transformação angular é normalmente aplicado em proporções, tal como P 2, antes da utilização de testes paramétricos 31. </li><li> As diferenças de acasalamento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular o número de fêmeas acasaladas duplamente e aqueles que só acoplado com o primeiro macho (o macho de referência no ensaio de ataque e o macho experimental no defense ensaio). Usando um teste exato bicaudal de Fisher (disponível em <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), determinar se existem diferenças estatisticamente significativas entre os dois tipos de homens experimentais. </li><li> Distribuição por sexo (opcional). Para cada homem experimental, utilize o teste do qui-quadrado para determinar se a proporção entre os sexos na progênie de cada um se desvia do sexo feminino a partir da proporção 1:1 esperada. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos o projeto experimental para avaliar as diferenças na contribuição relativa de organismos geneticamente distinto D. melanogaster machos à progênie em experimentos controlados duplo-acasalamento 7,8. Isto foi realizado no contexto de um factor genético hipótese de influenciar a capacidade competitiva do esperma e que tenha sido ilustrada no ensaio de ataque, embora um procedimento semelhante aplica-se ao ensaio de defesa (Figura 1). Esta concepção experimental...

Desde Geoff Parker observou a prevalência de competição do esperma nos insetos e suas implicações evolucionárias 2, uma onda de estudos em Drosophila e outras espécies têm tentado lançar alguma luz sobre este fenômeno em muitos níveis diferentes. Alguns exemplos de áreas de interesse foram o levantamento de sua variação em populações naturais 9,10, sua arquitetura genética e relevância de fatores genéticos subjacentes 11-14, e seu papel na condução de co-evolução entre os sexos 15,16. Em D. melanogaster fêmeas, a capacidade limitada dos órgãos de armazenamento de esperma especializados, um par de espermateca e receptáculo seminal 6,17, contribui para a competição do esperma de diferentes homens. Aproximadamente 1.500 esperma são transferidos durante o acasalamento à fêmea, mas apenas ~ 500 podem ser acomodados nos órgãos referidos 18,19. No laboratório, controlada acasalamento dupla experimentos envolvendo um homem de referência e um ou mais machos de juros têm sido amplamente utilizados para avaliar a capacidade competitiva do esperma 7,8. A capacidade competitiva de esperma é estimada como a percentagem de crias desejado pelo macho experimental nas experiências de acasalamento-duplo ao longo da descendência total, ou seja, que tanto do sexo masculino de referência e experimental. A capacidade competitiva de esperma compreende dois componentes, cada um deles avaliada num ensaio separado. No ensaio de ataque, a capacidade do esperma do homem experimental para deslocar o esperma do primeiro macho, ou seja, o macho de referência, é avaliada. Por outro lado, no ensaio de defesa, a capacidade do esperma do homem experimental para resistir deslocamento ou para reduzir o sucesso da fertilização do espermatozóide referência é avaliada. Dependendo do tipo de ensaio, a defesa ou ofensa, capacidade competitiva de esperma é estimado através dos pontos P 1 ou P 2, respectivamente. P1 e P 2 só pode assumir valores entre 0 e 1. Os valores intermediários são geralmente interpretados como evidência indireta de esperma de mistura, o que sugere um cenário fisiológico que envolve a competição do esperma direto. Seguindo o mesmo raciocínio, valores extremos pode ser interpretado como evidência de forte diferencial esperma capacidade competitiva. Estudos anteriores mostraram que a P 2 em D. melanogaster é acima de 0,8, como o aumento do tempo decorrido entre os dois cruzamentos prolonga 7. Este mesmo modelo experimental foi usado em outras espécies de Drosophila, P 2 ser a estatística utilizada em estudos para avaliar a capacidade competitiva de esperma 20. Para a maioria das espécies, os valores das duas estirpes testadas P é superior a 0,6 21. No entanto, vários outros mecanismos não relacionados à concorrência directa entre espermatozóides de diferentes machos podem produzir notas idênticas (ver discussão). Dprogenitura istinguishing desejado pelos primeiros ou segundos machos é possível através do uso de marcadores facilmente identificáveis. Em estudos iniciais, um dos machos foi irradiada com doses subletais de, por exemplo, raios X, que praticamente todos os óvulos fertilizados por esperma irradiado não eclodiram 7. Posteriormente, as mutações que alteram a pigmentação dos olhos ou forma de asa foram os marcadores mais usados. Os exemplos do anterior são as mutações pv (castanho) 9, CN (cinábrio) e 22 W (branco) 23, enquanto que a mutação CY (encaracolado) 24 corresponde ao segundo tipo de fenótipos, alguns destas mutações foram combinadas no mesmo indivíduo, por exemplo, cn bw. Em menor medida, isoenzimas 25 e 26,27 microssatélites com padrões de herança conhecidos também têm sido utilizados. O delineamento experimental para testar as diferenças decapacidade competitiva esperma descrito aqui segue essencialmente o de Clark et al. 9. Os resultados obtidos a partir desses experimentos dar informações apenas sobre a paternidade diferencial dos tipos masculinos experimentais sob escrutínio. Ensaios que também fazem provisão para diferenças pós-fertilização na aptidão 14,28 e técnicas de visualização de esperma 24 permitir diferenças de P 1 (ou P 2) marca a ser interpretado como diferenças na competência do esperma. A Figura 1 descreve a lógica tanto da ofensa e os ensaios de defesa. Para ilustrar a logística do processo, uma ofensa experimento realizado em D. melanogaster 14, será explicada em detalhe. Este ensaio ofensa particular foi usado para testar um efeito mensurável do multigene família cadeia intermediária dynein específico Sperm (Sdic) sobre a capacidade competitiva do esperma. Todos os Estados-s desta família multigene residem em conjunto no cromossomo X. Homens Knockout foram geradas, suprimindo o cluster Sdic. Porque o segmento excluído também incluiu o essencial curto asa gene (sw) eo objetivo do estudo foi avaliar a relevância de Sdic, os homens portadores da deleção Sdic-sw foram resgatados por uma cópia transgênica do sw (simbolizado como P {sw} , que também realizado um mini-gene repórter de branco) no cromossoma 2. Cor dos olhos foi usado como um marcador visível para identificação de paternidade. Todas as moscas estavam num fundo branco mutante com a excepção daqueles a partir da estirpe de Oregon-R, que foram usadas como referência para os machos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

A competição entre os machos conspecíficas para fertilizar os óvulos é um dos mecanismos de selecção sexual, isto é, selecção que opera sobre a maximização do número de eventos de acasalamento bem-sucedido em vez de maximizar a sobrevivência e viabilidade 1. Competição do esperma representa a competição entre os machos depois da cópula com a mesma fêmea 2, no qual o esperma são coincidentes no tempo e no espaço. Este fenómeno tem sido relatada em diversas espécies de animais e plantas 3. Por exemplo, selvagens capturados D. fêmeas melanogaster geralmente contêm esperma 2-3 4 machos. Os espermatozóides são armazenados em órgãos especializados, com capacidade de armazenamento limitada, o que pode levar à concorrência directa do esperma de diferentes homens 2,5. Comparando esperma capacidade competitiva de machos diferentes de interesse (tipos masculinos experimentais) foi realizada por meio de experimentação controlada double-acasalamentots no laboratório 6,7. Resumidamente, uma única fêmea está exposto a dois machos diferentes consecutivamente, um macho experimental e uma referência masculina cross-acasalamento. O mesmo esquema de cruzamento é seguida usando outros tipos masculinos experimentais, facilitando assim a comparação indireta da capacidade competitiva de seu esperma através de uma referência comum. A fração de indivíduos filhas de os experimentais e de referência do sexo masculino é identificado por meio de marcadores, o que permite estimar a capacidade competitiva de espermatozóides usando expressões matemáticas simples 7,8. Além disso, a capacidade competitiva do esperma pode ser estimado em dois cenários diferentes dependendo se o macho experimental é o segundo ou primeiro a mate (ataque e defesa ensaio, respectivamente) 9, que se supõe ser o reflexo de diferentes atributos de competência. Aqui, descrevemos uma abordagem que ajuda a interrogar o papel dos diferentes fatores genéticos que supostamente sustentam tele fenômeno da capacidade competitiva do esperma em D. melanogaster.

A Tabela 2 resume algumas características marcantes de dois experimentos de ofensa (Ensaios 1 e 2), em que D. melanogaster machos experimentais com e sem (tipo I e II, respectivamente), um cluster Sdic funcional são comparados 14. Depois de levar em conta as diferentes incidências encontradas com algumas repetições 58-83% das mulheres foram encontrados para ser informativo e, portanto, as contagens de paternidade de seus descendentes poderiam ser usados ​​para o cá...

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Diferencial esperma capacidade competitiva entre<em&gt; Drosophila</em&gt; Homens com genótipos diferentes pode ser verificada através de experimentos double-acasalamento. Cada uma dessas experiências envolve um dos homens de interesse e um homem de referência. Marcadores facilmente identificáveis ​​na progênie permitem inferir da fração de indivíduos filhas de cada macho.

Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K visualizações.  University of California, Irvine. Diferencial esperma capacidade competitiva entre Drosophila Homens com genótipos diferentes pode ser verificada através de experimentos double-acasalamento. Cada uma dessas experiências envolve um dos homens de interesse e um homem de referência. Marcadores facilmente identificáveis ​​na progênie permitem inferir da fração de indivíduos filhas de cada macho.

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Biologia

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de imagem Ca 2 + Sinalização no esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro A ativação do Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imagem Alterar Forma Celular em Viver Drosophila Os embriões

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Ensaios de triagem para avaliação dos efeitos de Ca2 +médio-produção-sinalização e reacção acrossómica no esperma humano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Dissecando, consertando e visualizando o Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...