Este protocolo demonstra medidas padrão, refletindo a aptidão, em mosquitos aedes aegypti, esses parâmetros de aptidão foram escolhidos porque refletem o sucesso reprodutivo, são simples de medir e são comumente relatados na literatura. Para começar, coloque papéis de ovo em água estéril durante a noite no setor para chocar mosquitos transgênicos e selvagens. Permita que as larvas se alimentem ad libitum, fornecendo várias gotas de chorume de ração para peixes moídos.
Para garantir que os adultos sejam virgens, separe as pupas por sexo assim que emergirem, mova a pupa para uma lâmina de microscópio de vidro e remova o excesso de água com tecido para imobilizar a pupa. Sob um estereoscópio com ampliação de duas a quatro vezes, usando um pincel de ponta fina, posicione a pupa voltada para cima. Em seguida, analise visualmente a cauda em busca de diferenças na forma do lobo genital.
Coloque as pupas masculinas e femininas em copos de água separados em contenção adequada. Para cruzar o gene drive do tipo selvagem ou transgênico um ou o gene drive dois machos em massa com fêmeas do tipo selvagem virgem, adicione mosquitos anestesiados em proporções de cinco machos para uma fêmea em caixas de mosquitos contendo aproximadamente 150 mosquitos. Após dois a três dias, forneça uma fonte de sangue na gaiola para alimentar as fêmeas seguindo as práticas padrão de criação.
Separe as fêmeas alimentadas com sangue das fêmeas não alimentadas, examinando visualmente seus abdômens em busca de ingurgitamento e descartando os não alimentados parcialmente, alimentados e machos. Coloque as fêmeas ingurgitadas de volta em suas respectivas gaiolas. Após dois a três dias, coloque as fêmeas individuais em tubos cônicos de 50 mililitros forrados com papel de filtro pré-rotulado com lápis.
Encha todos os tubos com cinco mililitros de água da torneira. Coloque um pequeno pedaço de bola de algodão embebida em passas ou açúcar em cada tubo cônico. Deixe as fêmeas no setor por um a dois dias e deixe-as ovipositar.
Em seguida, conte o número de ovos em cada papel e calcule a fecundidade média, como o número de ovos contados em cada papel dividido pelo número de fêmeas rastreadas. Para secar os papéis de ovo, drene a água dos tubos e coloque-os de volta no setor. Para congelar as fêmeas alimentadas com sangue do estudo de fecundidade concluído, coloque as gaiolas de mosquito a menos 20 graus Celsius por aproximadamente 15 minutos.
Disseque a asa esquerda de cada mosquito, extirpando a articulação da asa e do tórax e removendo toda a asa. Usando uma pinça, coloque a asa plana em uma lâmina de vidro e, em seguida, adicione uma gota da solução estoque de 15 mililitros contendo 70% de etanol e uma gota de detergente na asa da lâmina usando uma pipeta de transferência. Em seguida, adicione uma gota de glicerol a 80% à lamínula e coloque-a em cima da asa na solução de sabão de etanol.
Fotografe as asas montadas nos slides usando uma câmera com lente de 65 milímetros. Use o software TpsDig para identificar coordenadas cartesianas bidimensionais para os pontos de referência. Calcule o comprimento e a área da asa usando o script R fornecido no manuscrito.
Calcule o tamanho do centróide da asa, que é uma medida de tamanho, estatisticamente independente da forma definida como a raiz quadrada da soma das distâncias quadradas de cada ponto de referência a partir do ponto central da asa Choque ovos F1 individuais dos papéis coletados de fêmeas solteiras em recipientes transparentes de polipropileno contendo 100 mililitros de água deionizada recém-esterilizada. Dois a três dias após a eclosão, remova os papéis de ovo da água e deixe-os secar durante a noite. Escotilha novamente os papéis de ovo nos mesmos recipientes em que foram inicialmente chocados.
Três a cinco dias após a eclosão inicial, inspecione visualmente as larvas em busca de um marcador transgênico. Registre o número de larvas transgênicas positivas ou negativas. Descarte as larvas negativas.
Calcule a fertilidade como o número de larvas transgênicas ou de controle dividido pelo número total de ovos. Para determinar a proporção sexual, adicione o número de fêmeas ou o número de machos coletados ao longo da linha do tempo do estudo por mosquito fêmea adulto individual. Divida esse número pelo número de pupas coletadas para a mesma linhagem de mosquito gerada por uma única fêmea.
Para determinar a viabilidade das larvas, adicione o número total de pupas coletadas ao longo da linha do tempo do estudo por mosquito fêmea adulta. Divida esse número pelo número de larvas contadas por mosquito fêmea adulta individual para a mesma linha contada anteriormente. Calcule o desenvolvimento de larvas para pupas como o tempo médio para o desenvolvimento de pupas após a eclosão.
Para determinar a contribuição masculina, cruze 50 machos transgênicos ou de controle com 100 fêmeas de controle em caixas de 64 onças para que haja 50 machos com 100 fêmeas. Após o acasalamento, ofereça aos mosquitos uma refeição de sangue, seguindo as práticas padrão de criação. Em seguida, separe as fêmeas individuais totalmente ingurgitadas em tubos cônicos de 50 mililitros forrados com papel de filtro branco pré-rotulado.
Deixe as fêmeas por um a dois dias no setor e deixe-as ovipositar. Deixe os papéis secarem em tubos no setor por pelo menos cinco dias. Use uma pinça para remover os papéis e colocá-los para hachurar.
Dois a três dias após a eclosão, remova os papéis de ovo da água e deixe-os secar. Choque novamente os papéis de ovo nos mesmos recipientes. Três a cinco dias após a eclosão inicial, inspecione visualmente as larvas em busca de um marcador transgênico.
Calcule a contribuição masculina como o número de larvas transgênicas F2 dividido pelo número de larvas totais por linhagem de mosquito. Transfira 50 mosquitos machos e 50 fêmeas do tipo selvagem ou transgênico com idade correspondente não alimentados com sangue para um recinto adequado. Rastreie o número de mosquitos machos e fêmeas mortos a cada dia.
Calcule a longevidade como o número médio de dias passados antes que os mosquitos morram nas gaiolas, omitindo os mosquitos que morrem de causas não informativas. Larvas para pupas adultas e pupas para o tempo de desenvolvimento adulto foram avaliadas com uma ANOVA de Kruskal-Wallis e comparações post hoc de Dunn. Os mosquitos machos do tipo selvagem tiveram um tempo de pupação mais curto do que as fêmeas do tipo selvagem, enquanto os machos D7L1 não diferiram significativamente em seu tempo de pupação em relação às fêmeas D7L1.
As fêmeas D7L1 demoraram mais para atingir a pupação do que as fêmeas do tipo selvagem, assim como os machos D7L1, em relação aos machos do tipo selvagem. Em relação às pupas para o tempo de desenvolvimento adulto, as fêmeas do tipo selvagem e D7L1 não diferiram significativamente, os machos do tipo selvagem pupam mais rapidamente do que as fêmeas do tipo selvagem e os machos D7L1. Os mosquitos fêmeas do tipo selvagem nunca atingiram seu tempo médio de sobrevivência durante o estudo.
Todos os outros grupos atingiram sua sobrevida mediana antes de 40 dias, com uma separação temporal distinta dos tempos médios de sobrevida. Os mosquitos knockout D7L1 tinham uma área de asa significativamente menor do que seus equivalentes do tipo selvagem, mas não houve diferenças no tamanho da asa ou do centróide. Os mosquitos que abrigam uma cópia de um de gene drive sob a expressão dos nanos ou promotores de ZPG não tiveram aptidão significativamente diferente em comparação com a linha de olho larga de Higgs, com a notável exceção da viabilidade da larva.
Os dados de condicionamento físico coletados aqui podem ser usados em aplicativos downstream, como modelagem matemática. Para estudos que avaliam novas estratégias de controle genético, estudos maiores em gaiolas em condições de semicampo seriam necessários após os estudos de aptidão de pequenas habilidades descritos aqui. Estudos de condicionamento físico no laboratório ajudam a identificar efeitos não intencionais de nocautes genéticos ou knockins.
Nocautear uma proteína salivar pode induzir estresse no desenvolvimento, enquanto o gene drive nos mosquitos gene drive um e dois mostrou taxas de sobrevivência de larvas mais baixas. A medição da aptidão gênica influenciou fortemente sua persistência na simulação de populações após modelagem matemática.
