Сегодня мы продемонстрируем метод скрининга библиотеки пептидов против недавно обнаруженного главного рецептора, который является mas-связанным рецептором G-белка X2, также известным как рецептор MRGPRX2. Тустовые клетки являются неотъемлемой частью иммунной системы и играют решающую роль как во врожденных, так и в адаптивных иммунных реакциях. Тучные клетки активируются либо антиген-связанным рецептором Fc epsilon R1, либо недавно обнаруженным рецептором X2.
Активация поверхностно-связанного рецептора X2 была связана с несколькими иммунологическими и воспаленными заболеваниями, и, следовательно, важно понять механизм связывания этого рецептора с его лигандами. Для этого мы разработали библиотеку небольших пептидных молекул и проверили их на рецепторы X2, чрезмерно экспрессируемые на гексисе. В ходе исследования была построена библиотека пептидов с использованием простых и универсальных методов сканирования аланина и усечения аминокислот.
Heck293 говорит, что экспрессия рецепторов X2 при активации с помощью пептидов и широкотипных гексисов использовались в качестве контроля. В усечении освобождение при активации отслеживалось для изучения активации на основе X2. Экспериментально Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye возбуждается на 340 и 380 нанометрах, в то время как излучение регистрируется на 510 нанометрах.
При связывании кальция интенсивность флуоресценции на 340 увеличивается, в то время как интенсивность флуоресценции на 380 нанометров уменьшается. Затем краситель наносится в соотношении интенсивности флуоресценции на уровне 340 к 380 нанометрам. 340 из соотношения 380, пропорционально внутриклеточному кальцию, значение которого можно рассчитать по уравнению Гринкевича.
Обнаружен коэффициент табуляции двух интенсивностей флуоресценции, влияние экспериментальных факторов, таких как разбавление, фотоотбеливание, утечка красителя и плотность запаха. Итак, без дальнейших проволочек, начнем эксперимент. Для идентификации лигандов рецептора MRGPR X2 тучной клетки, генератора N-усеченной, С-усеченной и N+C-усеченной библиотеки пептидов путем усечения N-концевой, С-концевой и N+С-концевой аминокислот с неправильной проктивностью pam-12.
Используйте синтез твердофазных пептидов для синтеза пептидов. Измените конечный терминал на заданную приливную группу, а C-терминал на амидную группу. Генерировать и аланины могут пептидную библиотеку, заменяя соответствующие аминокислоты пам-12 аланином, по одной за раз.
Измените конечный терминал на setide группу, а C-терминал на амидную группу. Готовят культуральную среду, дополняя высокий уровень глюкозы DMEM, с 10% фетальной бычим сывороткой, двумя миллимолярами L-глутамина, сотней единиц на мл пенициллина и сотней микрограммов на мл стрептомицина. Кроме клеток в тройнике сью культуры, 375 культурная колба при 37 градусах Цельсия, 5% CO2, до тех пор, пока они не будут от 75 до 80% вливаться.
Как только 75% слится, промыть клетки и добавить два-три мл Proof-C, чтобы отсоединить клетки. Как только ячейки отделятся, соберите ячейки в Proof-C. Добавить шесть-девять мл свежей среды.
Центрифугировать клетки при 1620 г в течение трех-пяти минут. После центрифугирования выбросьте супернатант для сбора гранул. Повторно суспендирует клетки в свежей питательной среде.
Разбавить клетки, в соответствии с желаемой концентрацией. На 200 микролитров клеточной суспензии с концентрацией 200 000 клеток влейте амбон в каждую лунку, чтобы найти 40 000 клеток на лунку. Охраняют клетки в течение 24 часов в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
Используйте краситель Fura-2 AM для эксперимента. Добавьте 50 микролитров ДМСО в 50 мкг Fura-2 AM, чтобы приготовить один миллимолярный раствор красителя Fura-2 AM. Добавьте один микролитр одного миллимолярного красителя Fura-2 AM на мл свежей среды, чтобы подготовить разбавляющую среду с одной концентрацией микромолярной смолы.
Извлеките 96-колоденую пластину из инкубатора и выбросьте среду. Замените среду свежей разбавляющей средой. Добавьте в каждую лунку по 200 микролитров разбавляющей среды.
Инкубируют клетки в течение 30-40 минут при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 инкубатора. Пока клетки инкубируются, установите считыватель пластин. Установите температуру на 37 градусов по Цельсию.
В настройках выберите Flex. Установите режим чтения на Флуоресценция и Нижнее чтение. В области длин волн установите число длин волн до двух.
Установите возбуждение на 340 нанометров и 380 нанометров. Установите значение Emission (Излучение) на 510 нанометров. Оставьте значение чувствительность значение По умолчанию.
В области Синхронизация установите интервал равным 3,9 секунды. Установите время выполнения на 94 секунды, чтобы получить 25 чисел чтения. Затем выберите тип пробирной пластины.
Затем выберите Колодцы для чтения. В составной передаче установите передачу в один, а начальный объем в сто микролитров. Установите для pipette Height значение ста микролитров, Volume — 50 микролитров и Time Point — 36 секунд, чтобы добавить соединение и выполнить анализ.
Затем выберите тип пластины «Составной источник». Оставьте Тритурат не использовать. Выберите макет Подсказок и наконечников пипетки.
Для составных и кончиковых колонн соединение будет перенесено в одну колонну составной пластины. Задайте для столбца Подсказка значение один, а для столбца Составной — значение одного. Оставьте для кнопки Автокалибровка для Вкл.Нажмите кнопку ОК. После 40 минут инкубации удалите среду.
Промывайте ячейки буфером XDB. Добавьте сто микролитров буфера XDB для флуоресцентного считывания. Возьмите пластину для флуоресцентных показаний.
Когда притчетт достигнет 37 градусов по Цельсию, нажмите камеру считывания, чтобы поместить пробирную пластину в считыватель флуоресцентной пластины. Нажмите на источник, чтобы положить составную пластину. Подготовьте составную пластину, добавив 200 микролитров уважаемых пептидов иономизина и EGTA для превращения растворов X.
Нажмите на подсказку, чтобы положить наконечник. Используйте черный наконечник, чтобы избежать автофлуоресценции наконечника. После того, как пластины были сохранены, и если вы используете настройки программного обеспечения и нажимаете Read.
Определите концентрацию кальция из коэффициента флуоресценции по уравнению Гринкевича. Показаны данные флуоресценции хорошего пептида pam. Как видно, после добавления пептида через 36 секунд флуоресценция на 340 нанометрах, то есть более люкерная, увеличивается на 380 нанометров рекордной.
Данные представлены в виде отношения 340 к сигналу 380. Они показывают, что сигналы увеличиваются после добавления пептида. Этот показатель является репрезентативными данными для активирующего пептида.
На рисунке А показаны флуоресцентные сигналы для активирующего пептида. Репрезентативные данные соответствуют cram12 Пептид был добавлен после создания базового уровня для тендерных циклов, как показано в ado. На рисунке В показано отношение флуоресцентного излучения после возбуждения на 340 нанометров к соотношению флуоресцентного излучения после возбуждения на 380 нанометрах.
Этот рисунок представляет данные репрезентативного для бланка. На рисунке А показаны флуоресцентные сигналы для заготовки. HTB добавляли после разбавления исходного уровня в течение 10 циклов кормления, как показано в ado.
На рисунке В показано измерение излучения флуоресценции после возбуждения на 340 нанометров к коэффициенту излучения флуоресценции после возбуждения на 380 нанометров. Этот показатель является репрезентативными данными для стандартов калибровки красителей. Рисунок А показывает, что иономицин был добавлен при 10-м чтении, как показано ado, чтобы получить максимальную флуоресценцию в состоянии, связанном с кэшемом.
EGPA Triton X hundred был добавлен после 20 показаний, как показывают ado, которые получают минимальный сигнал. На рисунке В показано отношение флуоресцентного излучения после возбуждения на 340 нанометров к соотношению флуоресцентного излучения после возбуждения на 380 нанометрах. Эти значения далее помещаются в уравнение Гринкевича, чтобы получить внутриклеточный кэш концентрации.
На этом рисунке показана характеристика репрезентативного пептида для подтверждения последовательности и чистоты. На рисунке А показана вертикальная масса репрезентативной пептидной последовательности WNK WAL при истончении 857,90 красителя. Что показано отношением N к Zed в масс-спектроскопии.
На рисунке В показана чистота пептидов 99%, подтвержденная ВЭЖХ. Этот пептид относится к N+C-усеченной библиотеке пептидов. В заключение, метод, описанный здесь, является простым и универсальным, который может быть эффективным и ярким для последнего масштаба скрининга на основе кальция.
Тем не менее, есть несколько факторов, которые определяют качество данных, и, таким образом, состав должен быть оптимизирован для данной системы клеточного прибора. Спасибо.
