Este método pode ajudar a responder às perguntas na interação proteína-proteína, nos permitirá detectar diretamente duas proteínas localizadas dentro de 10 nanômetros uma da outra dentro da célula viva. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples e fácil de reproduzir. Também requer materiais simples que estão disponíveis em muitos laboratórios modernos.
Esta medida pode ser usada com qualquer tecido vivo ou célula de cultura que se espalhe transitoriamente na proteína de interesse. Se você usar essa técnica pela primeira vez, é recomendável usar o controle positivo e o controle negativo para testar o sistema primeiro. Para começar, semeie sementes de Nicotiana benthamiana em um vaso contendo solo úmido em alta densidade.
Mantenha as sementes plantadas em uma câmara de crescimento definida a 23 graus Celsius. Quando o diâmetro do eufilo atingir 0,3 a 0,5 centímetros, transfira as mudas para vasos maiores e deixe-as crescer na mesma câmara com os mesmos parâmetros. Em seguida, prepare as células bacterianas para a agroinfiltração, inoculando cada colônia de agrobactérias contendo os construtos de FRET em cinco mililitros de meio LB suplementado com antibióticos e 150 acetoseringona micromolar.
Incubar a cultura durante a noite a 28 graus Celsius. Após a incubação, centrifugar as células a 3 000 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Ressuspender as células em tampão de agroinfiltração para um OD 600 de 0,5.
Para a agroinfiltração de dupla construção, combine as células ressuspensas em uma proporção de volume de um para um com células que abrigam as construções apropriadas. Incubar as células a 28 graus Celsius por 30 minutos a uma hora. Para realizar a agroinfiltração, carregue a cultura bacteriana em uma seringa sem agulha de um mililitro.
Suavemente, mas com firmeza, pressione o bocal da seringa contra o lado abaxial das folhas de Nicotiana benthamiana totalmente expandidas enquanto segura a folha com um dedo enluvado no lado adaxial. Infiltre-se em até quatro pontos em uma folha, três folhas por planta e duas ou três plantas para cada cultura bacteriana. Manter as plantas agroinfiltradas na mesma câmara de crescimento nas mesmas condições descritas anteriormente por 24 a 36 horas.
Após 24 a 36 horas de infiltração, use uma lâmina de barbear para cortar cada folha agroinfiltrada em pequenos pedaços de dois por quatro milímetros entre as veias. Coloque as peças foliares em uma lâmina de vidro com a superfície da folha abaxial voltada para cima. Coloque uma gota de água sobre as peças das folhas e cubra-as com o vidro da tampa.
Bata levemente no vidro da tampa para remover as bolhas de ar. Em seguida, ligue o microscópio e o laser. Coloque a lâmina no suporte do palco do microscópio.
Para configurar os parâmetros para o SE-FRET, abra a ferramenta de aquisição multidimensional. Em seguida, defina o canal doador para excitação e emissão do GFP de fluorocromo do doador em um laser de excitação de 405 nanômetros e filtro de emissão em 400 a 597 nanômetros. Ajuste o canal aceitador para excitação e emissão do aceptor fluorocromo mRFP e um laser de excitação de 561 nanômetros e filtro de emissão em 400 a 597 nanômetros.
Ajuste o canal FRET para excitação do doador e emissão dos fluorocromos aceptores com um laser de excitação de 405 nanômetros e filtro de emissão de 597 a 617 nanômetros. Defina a intensidade de excitação do doador em um nível mínimo para observar o FET, evitando o fotobranqueamento. Excite o doador e procure células que contenham o sinal de fluorescência esperado do aceitador.
Selecione a região que contém o sinal de fluorescência de interesse. Adquira uma sequência de imagens SE-FRET pressionando o botão de encaixe. Para configurar parâmetros para o AB-FRET, utilize os parâmetros do canal doador e do receptor definidos para o SE-FRET, mas desligue o canal FRE.
Em seguida, prepare-se para definir os parâmetros para o fotobranqueamento do aceptor mRFP. Certifique-se de que o branqueamento comece após cinco imagens. Permita 200 iterações para cada alvejante da área.
Mantenha 100% de intensidade de laser a 561 nanômetros. Mantenha uma duração de branqueamento de 45 segundos. Garanta uma velocidade de digitalização de 512 por 512 pixels a 400 hertz.
Pesquise e desenhe a região da célula a ser branqueada e ative o branqueamento pressionando o botão Iniciar experimento. No caso do controle positivo, após cinco imagens, o clareamento começa e a região de interesse fica verde. Verifique o ROI médio para confirmar que a intensidade da mRFP está diminuindo, enquanto a da GFP está aumentando.
Alternativamente, verifique o layout, que mostra que o mRFP estava clareando e o GFP estava aumentando. Para analisar dados SE-FRE, use o software ImageJ. Abra as imagens e crie uma pilha de doadores apenas.
Salve as imagens em oito bits como arquivo TIF. Da mesma forma, crie a pilha apenas para o aceitador e, em seguida, crie uma pilha combinada de doador e aceitador. Em seguida, use o plugin PixFRET para gerar imagens da eficiência SE-FRE.
Abra as pilhas criadas e gere as imagens FRET corrigidas depois de subtrair a sangria espectral. Apresente a imagem como imagem pseudocolorida. Para analisar os dados AB-FRET, calcule a porcentagem AB-FRET como o aumento percentual na emissão de GFP após o fotobranqueamento mRFP usando esta fórmula.
A interação proteína-proteína específica da histona desubiquitinase OTLD1 com um fator de transcrição LSH10 foi estudada pelo SE-FRET. Os núcleos celulares foram registrados simultaneamente em três canais, e uma escala de pseudocores foi gerada para descrever a eficiência do SE-FET. A transição do azul para o vermelho corresponde a um aumento na eficiência do FRET e na proximidade proteína-proteína.
A intensidade de SE-FRET após a co-expressão de LSH10 e OTLD1 foi comparável à observada para o controle positivo mRFP-GFP. Nenhum SE-FRET foi observado em controles negativos, como a co-expressão de OTLD1, mRFP e LSH4-GFP, ou mRFP livre e LSH10-GFP. As imagens AB-FRET mostraram que a co-expressão de LSH10-GFP e OTLD1-mRFP resultou em um aumento da fluorescência do doador de GFP após o aceptor de RFP ser fotobranqueado.
Um aumento semelhante na fluorescência do doador foi observado no controle positivo, mas não nos controles negativos quando a fluorescência do aceptor foi inativada. A análise quantitativa dos dados AB-FRET demonstrou um aumento estatisticamente significativo na fluorescência do doador após a coexpressão de LSH10 e OTLD1. O controle positivo produziu um percentual AB-FRET de aproximadamente 30%, enquanto os controles negativos não produziram nenhum.
SE-FRET e AB-FRET mostraram um sinal no núcleo celular consistente com a localização subcelular dos complexos enzimáticos modificadores de histonas do fator de transcrição, bem como com a natureza nucleocitoplasmática das proteínas GFP-MRFP. A coisa mais importante a lembrar antes de seguir o protocolo é testar o par expresso do aceitador do doador direito, dependendo do modelo de nanoscopia confocal. Depois de executar e fazer nossa iteração, são apenas 24 a 36 horas para receber os resultados.
Depois de assistir a este vídeo, deve-se ter uma boa compreensão de como usar a técnica FRET para estudar a interação proteína-proteína.
