Este protocolo é significativo porque descreve outra ferramenta importante para dissecar a biologia molecular do agente da doença de Lyme Borrelia burgdorferi. A principal vantagem desta técnica é que, ao utilizar a transdução de fagos, ela fornece um método alternativo para a introdução de DNA na Borrelia burgdorferi sem a necessidade da aplicação de um pulso elétrico, como na eletroporação. Este método poderia ser usado para fornecer mais informações sobre os mecanismos moleculares utilizados por Borrelia burgdorferi para persistir em seu ciclo enzoótico e, finalmente, causar a doença de Lyme em humanos.
Para começar, inocular 150 microlitros do clone apropriado de Borrelia burgdorferi em 15 mililitros de BSK em tubos de centrífuga cônica estéreis bem tampados para o protocolo de transdução. Em seguida, complementar o meio com a concentração apropriada de antibióticos ou uma combinação de antibióticos para a seleção e manutenção de DNA heterólogo dentro do clone de Borrelia burgdorferi e incubar a amostra a 33 graus Celsius. Após o crescimento da cultura, centrifugar o volume apropriado de cultura a 6.000 G por 10 minutos.
Após a decantação do sobrenadante, ressuscite o pellet em quatro mililitros em BSK fresco e transfira a amostra para o menor tubo estéril disponível para manter a amostra com o mínimo de espaço na cabeça. Em seguida, adicione a quantidade apropriada de agente indutor à concentração recomendada com base em um volume de cultura de quatro mililitros para induzir a produção de fagos, tampar o tubo firmemente e misturar completamente. Incubar a amostra a 33 graus Celsius por duas a quatro horas.
Em seguida, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar a amostra a 6 000 G durante 10 minutos. Após decantar o sobrenadante, ressuspeite o pellet celular em 15 mililitros de BSK.
Complementar a cultura preparada com a concentração adequada de antibióticos descrita no manuscrito, enquanto incuba a amostra a 33 graus Celsius por 72 a 96 horas. Para preparar soluções para a precipitação de PEG, prepare 500 mililitros de cloreto de sódio de cinco molares, 500 mililitros de 40% de PEG e 100 mililitros de meio de suspensão, conforme descrito no manuscrito. Para esterilizar, autoclave a solução, esfrie antes do uso e armazene a temperatura ambiente ou quatro graus Celsius.
Para a precipitação de PEG do fago do clone doador Borrelia burgdorferi, após 72 a 96 horas de incubação, centrifugar as amostras a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mililitros e descartar a pelota celular. Adicionar cloreto de sódio de cinco molares a uma concentração final de um molar.
Depois de misturar bem, agite suavemente à temperatura ambiente durante uma hora. Centrifugar as amostras a 8 000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Depois de decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mililitros, como demonstrado anteriormente, adicione a solução de 40% de PEG-8000 ao sobrenadante até uma concentração final de 10%Misture bem e coloque no gelo por mais de uma hora, até a noite.
Centrifugar para as amostras a 8.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius, como demonstrado anteriormente. Descarte o sobrenadante e remova o máximo de líquido possível sem perder nenhum pellet, que contém as partículas do fago. Ressuspeite o pellet em um volume mínimo de meio de suspensão usando o meio de suspensão para lavar o lado da garrafa e coletar quaisquer partículas potenciais de fago.
Trate a amostra de fago recuperada com um volume igual de clorofórmio com base no volume de ressuspensão. Misture bem a amostra e centrifugar a 8.000 G por 10 minutos. Em seguida, remova a camada aquosa para um tubo limpo, evitando qualquer uma das camadas de interface espessas.
Após a determinação do volume recuperado, após o primeiro tratamento com clorofórmio, trate novamente a amostra com uma quantidade de clorofórmio igual a 10% desse volume. Transfira a camada aquosa para um tubo limpo, tendo o cuidado de evitar qualquer uma das camadas de interface ou orgânicas. Use o fago imediatamente ou armazene-o a quatro graus Celsius.
Após o preparo das culturas de Borrelia burgdorferi para serem utilizadas como receptoras em ensaios de transdução, como demonstrado anteriormente, centrifugar o volume de cultura a 6.000 G por 10 minutos. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 14,5 mililitros de BSK fresco. Adicione menos ou igual a 500 microlitros de amostra de fago precipitado por PEG à cultura do clone receptor.
Depois de misturar bem, incubar a 33 graus Celsius por 72 a 96 horas. Realizar a seleção de transdutores por chapeamento em fase sólida após mistura com fago precipitado por PEG conforme descrito no manuscrito. Dependendo do contexto do clone receptor, verifique se as colônias aparecem dentro da agarose nas placas de seleção após 10 a 21 dias de incubação.
Escolha pelo menos 5 a 10 colônias que crescem na placa na presença de ambos os antibióticos usando pipeta de borossilicato de 5,75 polegadas com algodão esterilizado e inocule-as em 1,5 mililitros de BSK com o antibiótico apropriado. A amplificação por PCR dos genes foi realizada em 10 dos clones que codificam a resistência à canamicina e gentamicina. O gene de resistência à canamicina pode ser amplificado a partir do doador c1673 e dos potenciais transdutores, mas não do receptor c1706.
Da mesma forma, o gene de resistência à gentamicina poderia ser amplificado a partir do receptor c1706 e dos potenciais transdutores, mas não do doador, representando eventos de transdução. Demonstrar que o de resistência à canamicina foi transduzido por 5BB1 do doador para o receptor. O fundo dos transdutores foi determinado usando marcadores específicos de deformação.
O clone c1673 e o fundo CA-112A codificam amplificadores específicos quatro, cinco e seis, enquanto c1706, que tem um fundo B31 de alta passagem, não. Da mesma forma, os transdutores um e dois estavam faltando amplicons quatro, cinco e seis, demonstrando que os clones têm o fundo c1706 e adquiriram o gene de resistência à canamicina a partir de c1673. Para a precipitação de PEG do fago, execute todas as etapas cuidadosamente para maximizar o rendimento do fago e trate o fago ressuspenso completamente com clorofórmio para remover o máximo possível de contaminantes de PEG e meios de cultura antes do uso e armazenamento do fago.
Uma vez que o ensaio de transdução tenha sido realizado com sucesso e o transdutor verificado, esses clones estão disponíveis para responder às perguntas que requerem Borrelia burgdorferi geneticamente modificada. Espera-se que o desenvolvimento desta técnica permita que os pesquisadores manipulem geneticamente cepas de Borrelia burgdorferi para as quais a introdução de DNA via eletroporação é atualmente difícil.
