A classificação das discinesias induzidas por L-dopa no modelo de rato 6-hidroxidopamina da doença de Parkinson é uma importante ferramenta pré-clínica para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes. Esse modelo é relativamente simples, apresenta baixo custo e tem semelhanças com o que acontece na clínica. O procedimento será demonstrado por Danilo Leandro Ribeiro, doutorando em laboratório.
Comece o experimento com ratos machos Sprague-Dawley, pesando de 200 a 250 gramas. Abrigar de dois a três animais por gaiola nas condições padrão de laboratório com comida e água disponíveis ad libitum. Antes da cirurgia, administre o inibidor do transportador de norepinefrina, a imipramina, ao rato por via intraperitoneal.
Depois de confirmar a anestesia pela falta de resposta à pinça do dedo do pé, posicione o rato em posição prona no aparelho estereotáxico em cima da almofada de aquecimento. Uma vez que o rato esteja posicionado, use um bisturi para fazer uma incisão de um centímetro de comprimento na região onde a microinjeção ocorrerá. Em seguida, limpe a região do crânio com cotonetes e certifique-se de que o bregma e o lambda estejam expostos.
Pegue o feixe estereotáxico medial, ou MFB, coordenadas estereotáxicas do bregma a 4,3 milímetros antes, 1,6 milímetros laterais ao lado direito e 8,3 milímetros ventrais do durômetro. Quando as coordenadas forem decididas, administrar a 6-hidroxidopamina, ou 6-OHDA, unilateralmente a uma taxa de 0,4 microlitros por minuto no MFB direito, com uma seringa de vidro Hamilton de 50 microlitros. Ao final da cirurgia, suture a incisão do couro cabeludo e reidrate o animal com solução salina quente, estéril, a 0,9% por via subcutânea, na dose de 10 mililitros por quilograma.
Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma gaiola de recuperação quente, enquanto monitora até que a consciência seja recuperada. Quatro semanas após a lesão, medir a eficácia da lesão dopaminérgica usando um teste de stepping, avaliando a acinesia do membro anterior contralateral à lesão. Ratos que apresentem três ou menos passos de ajuste com o membro anterior contralateral devem ser incluídos no estudo como ratos putativos e gravemente lesados por 6-OHDA.
Quatro semanas após as lesões da 6-OHDA, inicie o tratamento crônico na segunda-feira e registre movimentos involuntários anormais na quarta-feira. Para isso, coloque o rato dentro de um cilindro transparente com 20 centímetros de diâmetro e 40 centímetros de altura, e deixe que ele se aclimate, por pelo menos 15 minutos. Certifique-se de que o chão esteja coberto com o material de cama e que os espelhos estejam posicionados atrás do cilindro para observar o animal de todos os ângulos possíveis.
Posicione uma câmera de vídeo de alta resolução para permitir a visualização de movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais. Os espelhos atrás do cilindro permitirão rastrear movimentos involuntários anormais em um ângulo de 360 graus. A câmera pode ser posicionada ligeiramente abaixo do plano em um ângulo de 15 graus dos animais para observar movimentos involuntários anormais orolinguais.
Quando a posição for decidida, fixe a câmera diretamente no banco. Uma vez que o animal esteja aclimatado por 15 minutos, retire o animal do cilindro e administre cinco miligramas por quilograma de L-dopamina ou L-DOPA recém-preparada combinada com 12,5 miligramas por quilograma de benserazida, por via subcutânea. Coloque o animal de volta no cilindro e inicie um temporizador para rastrear movimentos involuntários anormais.
Use uma câmera de vídeo para gravar os movimentos involuntários anormais por 180 minutos após a injeção, em intervalos de 30 minutos, para realizar a pontuação off-line. Após os seis períodos de observação, os escores devem ser dados em épocas de um a dois minutos e classificados em axial, membro ou orolingual. Certifique-se de não incluir comportamentos normais.
O tratamento com L-DOPA e benserazida deve ser continuado por três semanas, uma vez ao dia, de segunda a sexta-feira. Na análise representativa do curso de tempo, os escores aplicados aos movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais ao longo de três semanas de administração crônica de L-DOPA são mostrados. Observou-se que as discinesias de dose máxima induzidas por L-DOPA ocorrem entre 30 a 90 minutos, com uma diminuição gradual após 120 minutos após a injeção.
Além disso, a soma dos movimentos involuntários anormais axiais, membros e orolinguais foi apresentada nos indivíduos, pontuando dias e semanalmente durante três semanas de administração crônica de L-DOPA. O protocolo de movimentos involuntários anormais é geralmente para a investigação de novas ferramentas terapêuticas com potencial translacional antidiscinético.
