O protocolo descreve um método para gerar um modelo ortotópico de câncer de pâncreas em camundongos usando um sistema que combina a injeção de células e a avaliação do enxerto e desenvolvimento de tumores. Esta técnica tem grande reprodutibilidade, é minimamente invasiva, permite superar muitas desvantagens causadas pelo procedimento cirúrgico e está em conformidade com os princípios dos 3R. A injeção ecoguiada pode ser usada para outros modelos ortotópicos, como injeções na árvore biliar ou modelos de câncer de mama.
O uso de tal técnica poderia ser acoplado ao uso de pequenas moléculas. Comece a preparar uma fêmea de 20 fêmeas de 20 Athymic Nude-Foxn-1nu de 8 semanas de idade para injeção guiada por ultrassom, administrando tramadol por via intraperitoneal a uma dose de 5 miligramas por quilograma usando uma seringa de tuberculina com uma agulha de calibre 27. Em seguida, ligue o gerador de imagens e selecione Mouse, Small, Abdominal" no menu de aplicativos do painel do transdutor.
Certifique-se de que a janela de imagem do Modo B ou Modo de Brilho seja exibida e que o sistema esteja pronto para adquirir dados do Modo B. Vá para o Navegador de Estudo para selecionar Novo Estudo" e digite o nome e as informações do estudo, como a data do estudo. Em seguida, preencha todas as informações necessárias no Nome da Série, como cepa animal, ID, data de nascimento.
Depois que as informações forem inseridas, toque em "Concluído" para preparar o programa para imagens do Modo B. Coloque o rato anestesiado no flanco direito sobre a mesa de manuseio aquecida a 37 graus Celsius com o focinho em um cone de nariz e aplique uma gota de pomada veterinária nos olhos do rato. Em seguida, use uma gaze adesiva para colar a mão direita, o pé direito e a cauda do mouse nas almofadas do eletrodo na plataforma do animal.
A taxa de respiração e o eletrocardiograma do rato são gravados através das almofadas dos eléctrodos. Antes de injetar o rato com células PANC1, higienize a pele do rato com etanol a 70% e mantenha a pele do flanco esquerdo esticada utilizando gaze adesiva. Use uma seringa de 20 mililitros sem a agulha para aplicar gel de ultrassom no abdômen e no flanco esquerdo do rato.
Com a ajuda do botão de controle de altura do transdutor de ultrassom, abaixe o transdutor para tocar o flanco esquerdo do mouse e coloque o transdutor transversalmente ao corpo do animal. Em seguida, mova o transdutor para visualizar o pâncreas na tela do transdutor usando imagens do modo B. Prepare uma seringa Hamilton de 50 microlitros, contendo 10 milhões de células PANC1 suspensas em 20 microlitros de PBS com uma agulha higienizada de 30 milímetros de calibre 28 e coloque a seringa no suporte apropriado.
Usando o micromanipulador do suporte, abaixe a seringa para a pele do rato, com o bisel da agulha virado para cima e no mesmo plano do transdutor de ultrassom, formando um ângulo de 45 graus com o transdutor. Perfure a pele com o micromanipulador e insira a agulha da seringa no pâncreas enquanto observa a imagem de ultrassom em exibição para seguir a trajetória. Uma vez que a agulha é inserida no pâncreas, injete um bolus de 20 microlitros contendo as células, aplicando pressão constante no êmbolo da seringa.
O procedimento de injeção correto pode ser verificado pela presença de uma pequena bolha no pâncreas e pelo fluxo de fluido hipoecogênico. Após 5 a 10 segundos da injeção, retraia a agulha. Em seguida, remova o transdutor de ultrassom e limpe o gel do flanco.
Quando terminar, coloque o rato sozinho numa nova gaiola sob observação até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. A imagem representativa mostra a presença de uma massa tumoral na cauda do pâncreas após injeção celular ecoguiada, confirmando a reprodutibilidade do protocolo. O volume tumoral de tumores pancreáticos ortotópicos derivados de células PANC1 foi avaliado por ultrassonografia uma vez por semana, a partir do Dia 8 após a injeção celular.
No ponto final do experimento, no Dia 43, foram adquiridas imagens ultrassonográficas das massas tumorais. No exame de necropsia, a massa tumoral, uma pequena porção de um pâncreas, baço, estômago e fígado saudáveis foi observada. Além disso, as massas tumorais foram explantadas para análise histológica.
É importante posicionar o rato do lado direito sobre a mesa, e a pele deve ser devidamente esticada para evitar o risco de as células se derramarem para fora do pâncreas. Aplicações futuras do modelo de câncer de pâncreas obtido pela injeção guiada por ultrassom incluem os estudos voltados para o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos apropriados ou combinações de tratamentos.
