Il protocollo descrive un metodo per generare un modello murino ortotopico di cancro del pancreas utilizzando un sistema che combina l'iniezione di cellule e la valutazione dell'attecchimento e dello sviluppo dei tumori. Questa tecnica ha una grande riproducibilità, è minimamente invasiva, consente di superare molti inconvenienti causati dalla procedura chirurgica e rispetta i principi delle 3R. L'iniezione eco-guidata potrebbe essere utilizzata per altri modelli ortotopici, come iniezioni nell'albero biliare o modelli di cancro al seno.
L'uso di tale tecnica potrebbe essere accoppiato con l'uso di piccole molecole. Inizia a preparare un topo femmina di 8 settimane 20 Athymic Nude-Foxn-1nu per iniezione guidata da ultrasuoni somministrando tramadolo per via intraperitoneale alla dose di 5 milligrammi per chilogrammo usando una siringa per tubercolina con un ago calibro 27. Quindi, accendere l'imager e selezionare Mouse, Small, Abdominal" nel menu dell'applicazione dal pannello del trasduttore.
Assicurarsi che venga visualizzata la finestra di imaging B-Mode, o Brightness Mode, e che il sistema sia pronto per acquisire i dati B-Mode. Vai al Browser dello studio per selezionare Nuovo studio" e digita il nome e le informazioni dello studio, come la data dello studio. Quindi, inserisci tutte le informazioni necessarie nel nome della serie, come ceppo animale, ID, data di nascita.
Dopo aver inserito le informazioni, toccare Fine" per preparare il programma per l'imaging B-Mode. Posizionare il topo anestetizzato sul fianco destro sul tavolo di manipolazione riscaldato a 37 gradi Celsius con il muso in un cono del naso e applicare una goccia di unguento veterinario sugli occhi del topo. Quindi, utilizzare una garza adesiva per fissare la mano destra, il piede destro e la coda del mouse sui cuscinetti degli elettrodi sulla piattaforma animale.
La frequenza respiratoria e l'elettrocardiogramma del topo vengono registrati attraverso i cuscinetti degli elettrodi. Prima di iniettare il topo con cellule PANC1, disinfettare la pelle del topo con etanolo al 70% e mantenere la pelle del fianco sinistro tesa usando una garza adesiva. Utilizzare una siringa da 20 millilitri senza ago per applicare il gel ad ultrasuoni sull'addome e sul fianco sinistro del mouse.
Con l'aiuto della manopola di controllo dell'altezza del trasduttore ad ultrasuoni, abbassare il trasduttore per toccare il fianco sinistro del mouse e posizionare il trasduttore trasversalmente al corpo dell'animale. Quindi, spostare il trasduttore per visualizzare il pancreas sul display del trasduttore utilizzando l'imaging B-Mode. Preparare una siringa Hamilton da 50 microlitri, contenente 10 milioni di cellule PANC1 sospese in 20 microlitri di PBS con un ago igienizzato da 30 millimetri calibro 28 e posizionare la siringa sul supporto appropriato.
Utilizzando il micromanipolatore del supporto, abbassare la siringa sulla pelle del topo, con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto e sullo stesso piano del trasduttore ad ultrasuoni, formando un angolo di 45 gradi con il trasduttore. Perforare la pelle con il micromanipolatore e inserire l'ago della siringa nel pancreas osservando l'immagine ecografica sul display per seguire la traiettoria. Una volta inserito l'ago nel pancreas, iniettare un bolo da 20 microlitri contenente le cellule applicando una pressione costante sullo stantuffo della siringa.
La corretta procedura di iniezione può essere controllata dalla presenza di una piccola bolla nel pancreas e dal flusso di liquido ipoecogeno. Dopo 5-10 secondi dall'iniezione, ritrarre l'ago. Quindi, rimuovere il trasduttore ad ultrasuoni e pulire il gel dal fianco.
Al termine, posizionare il topo da solo in una nuova gabbia sotto osservazione fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclienza sternale. L'immagine rappresentativa mostra la presenza di una massa tumorale nella coda del pancreas dopo l'iniezione cellulare eco-guidata, confermando la riproducibilità del protocollo. Il volume tumorale dei tumori pancreatici ortotopici derivati dalle cellule PANC1 è stato valutato mediante ecografia una volta alla settimana, a partire dal giorno 8 dopo l'iniezione cellulare.
Al punto finale dell'esperimento il giorno 43, sono state acquisite immagini ecografiche delle masse tumorali. Nell'esame necroscopico, è stata osservata la massa tumorale, una piccola porzione di pancreas, milza, stomaco e fegato sani. Inoltre, le masse tumorali sono state espiantate per l'analisi istologica.
È importante posizionare il mouse sul lato destro sul tavolo e la pelle deve essere adeguatamente tesa per evitare il rischio che le cellule fuoriescano dal pancreas. Le future applicazioni del modello di cancro del pancreas ottenuto dall'iniezione ecoguidata includono gli studi volti allo sviluppo di appropriati trattamenti terapeutici o combinazioni di trattamento.
