Протокол описывает метод генерации ортотопической мышиной модели рака поджелудочной железы с использованием системы, которая сочетает в себе инъекцию клеток и оценку приживления и развития опухолей. Эта методика обладает большой воспроизводимостью, является минимально инвазивной, позволяет преодолеть многие недостатки, вызванные хирургической процедурой, и соответствует принципам 3R. Эхо-управляемая инъекция может быть использована для других ортотопических моделей, таких как инъекции в билиарное дерево или модели рака молочной железы.
Использование такого метода может сочетаться с использованием малых молекул. Начните подготовку 8-недельной 20-тимочной самки мышей Nude-Foxn-1nu к ультразвуковой инъекции, вводя трамадол внутрибрюшинно в дозе 5 миллиграммов на килограмм с помощью туберкулинового шприца с иглой 27-го калибра. Далее включите тепловизор и выберите «Мышь», «Маленький», «Брюшной» в меню приложения с панели преобразователя.
Убедитесь, что появилось окно изображения B-Mode, или Режим яркости, и система готова к получению данных B-Mode. Перейдите в обозреватель исследований, чтобы выбрать «Новое исследование» и введите название исследования и информацию, например дату исследования. Затем заполните всю необходимую информацию в названии серии, например, штамм животного, идентификатор, дату рождения.
После ввода информации нажмите «Готово», чтобы подготовить программу для создания изображений в режиме B. Поместите обезболенную мышь на правый бок на стол для обработки, нагретый при 37 градусах Цельсия мордой в носовом конусе, и нанесите каплю ветеринарной мази на глаза мыши. Затем используйте клейкую марлю, чтобы заклеить правую руку, правую ногу и хвост мыши на электродные подушечки на платформе животного.
Частота дыхания мыши и электрокардиограмма регистрируются через электродные прокладки. Перед введением мыше клеток PANC1 продезинфицируйте кожу мыши 70% этанолом и держите кожу левого бока растянутой с помощью клейкой марли. Используйте 20-миллилитровый шприц без иглы, чтобы нанести ультразвуковой гель на живот и левый бок мыши.
С помощью ручки контроля высоты ультразвукового преобразователя опустите датчик, чтобы коснуться левого фланга мыши и поместите преобразователь поперечно к телу животного. Затем переместите датчик, чтобы визуализировать поджелудочную железу на дисплее датчика с помощью визуализации B-Mode. Подготовьте 50-микролитровый шприц Гамильтона, содержащий 10 миллионов клеток PANC1, взвешенных в 20 микролитрах PBS с помощью дезинфицированной 30-миллиметровой иглы 28-го калибра, и поместите шприц на соответствующий держатель.
Используя держатель микроманипулятора, опустите шприц к коже мыши, при этом иглой скосом лицом вверх и в той же плоскости, что и ультразвуковой преобразователь, образуя угол 45 градусов с датчиком. Перфорируйте кожу микроманипулятором и вставьте иглу шприца в поджелудочную железу, наблюдая за ультразвуковым изображением на дисплее, чтобы проследить траекторию. После того, как игла введена в поджелудочную железу, введите болюс размером 20 микролитров, содержащий клетки, оказывая постоянное давление на поршень шприца.
Правильная процедура инъекции может быть проверена наличием небольшого пузырька в поджелудочной железе и потоком гипоэхогенной жидкости. Через 5-10 секунд после инъекции втягивайте иглу. Затем снимите ультразвуковой преобразователь и очистите гель от пашины.
Когда это будет сделано, поместите мышь в одиночку в новую клетку под наблюдением, пока она не придет в достаточное сознание, чтобы поддерживать стернальное лежание. Репрезентативное изображение показывает наличие опухолевой массы в хвосте поджелудочной железы после эхо-управляемой клеточной инъекции, подтверждая воспроизводимость протокола. Опухолевый объем ортотопических опухолей поджелудочной железы, полученных из клеток PANC1, оценивали с помощью ультразвуковой визуализации один раз в неделю, начиная с 8-го дня после инъекции клеток.
В конечной точке эксперимента на 43-й день были получены ультразвуковые изображения опухолевых масс. При некропсии наблюдалась опухолевая масса, небольшая часть здоровой поджелудочной железы, селезенки, желудка, печени. Дополнительно опухолевые массы эксплантировали для гистологического анализа.
Важно расположить мышь на правой стороне стола, а кожу нужно правильно растянуть, чтобы избежать риска выплескивания клеток из поджелудочной железы. Будущие применения модели рака поджелудочной железы, полученной с помощью ультразвуковой инъекции, включают исследования, направленные на разработку соответствующих терапевтических методов лечения или комбинаций лечения.
