Este protocolo pode ser usado para construir modelos 3D de distribuição metabólito e parasita. Isso pode ajudar na compreensão da relação entre perturbação metabólica do tecido local, distribuição de parasitas e sintomas de doenças clínicas. A principal vantagem deste método é que ele permite o mapeamento entre órgãos em escala ao vivo da distribuição metabólito versus distribuição de patógenos e sua análise estatística.
Teoricamente, a cartografia química pode explorar o desenvolvimento e o impacto da doença no hospedeiro examinando diretamente os metabólitos responsáveis pela patogênese e os efeitos do tratamento. Comece pesando e rotulando os tubos. Se se sectionia os tecidos sistematicamente com uma seção por tubo.
Pese os tubos contendo amostras de tecido para determinar o peso da amostra e regissue o peso. Para realizar a homogeneização à base de água das amostras de tecido, adicione uma conta de aço inoxidável de cinco milímetros aos dois tubos de microcentrífuga mililitro contendo amostras de tecido. Faça um tubo em branco contendo água de grau LCMS.
Coma o volume para 500 microlitres por 50 miligramas da amostra adicionando água de grau LCMS refrigerado e, em seguida, homogeneize amostras a 25 hertz por três minutos. As amostras devem ser completamente homogeneizadas. Coletar 1/10 do volume de homogeneização para extração de DNA e outras análises.
Adicione o metanol de grau LCMS gelado cravado com quatro micromolar de sulfaclocloopyridazina ao homogeneizar. Homogeneize amostras em um homogeneizador de tecido a 25 hertz por três minutos, seguido de centrifugação por 10 minutos. Colete um volume igual de supernaspeso em uma placa de poço 96 e mantenha resíduos sólidos no gelo durante a coleta dos supernantes.
Seque a extração aquosa sobrenatante completamente usando velocidade máxima e sem aquecimento. Realize a extração orgânica adicionando 1.000 microliters de metanol de diclorometano pré-refrigerado cravado com dois micromolar sulfachloropyridazine por 50 miligramas de amostra de resíduos sólidos. Homogeneize amostras a 25 hertz por cinco minutos, seguida de centrifugação por 10 minutos.
Colete um volume igual de supernante em uma placa de 96 poços. Tire uma foto do órgão de interesse. Clique em Arquivo e, em seguida, importe no software SketchUp para importar uma imagem dos órgãos de interesse.
Clique na ferramenta de linhas e selecione a opção à mão livre. Use a ferramenta lápis para traçar e desenhar os contornos dos órgãos de interesse. Selecione a ferramenta push/pull e puxe para cima na área sombreada para converter o desenho de 2D para 3D.
Exporte o arquivo no formato dae clicando em Exportação de arquivos e, em seguida, modelo 3D. Para melhorar o realismo do modelo, importe o modelo para o software MeshLab selecionando File e, em seguida, clicando em Malha de Importação. Selecione Wireframe no menu superior e selecione Filtros, clique em Simplificação e Reconstrução de Remeshing e, em seguida, no Ponto Médio das Superfícies de Subdivisão.
Deixe todos os valores como padrão e selecione Aplicar duas vezes. Exporte o modelo em formato sdl clicando em Arquivo e, em seguida, em Export Mesh As e, em seguida, selecionando O formato de arquivo SDL nos arquivos do menu suspenso do tipo. Salve isso e selecione OK no próximo menu pop-up.
Abra o software Meshmixer e importe o arquivo sdl gerado na etapa anterior. Use a escultura, pincéis, escultura de dragão, pincéis, ferramentas de inflação para retirar as superfícies do modelo que precisam ser arredondadas. Salve-o no formato sdl uma vez que o modelo tenha a aparência desejada clicando em Arquivo e Exportação.
Nomeie o arquivo conforme desejado, selecione o formato binário SDL e salve. Abra o modelo 3D no software MeshLab. Clique em OK na janela popup de processamento aberto do post.
Obtenha coordenadas X, Y e Z para cada ponto de amostragem selecionando a ferramenta de pontos de escolha e, em seguida, clique com o botão direito do mouse em intervalos regularmente espaçados através da superfície do modelo 3D. Uma vez selecionadas todas as coordenadas desejadas, clique no botão Mais alto Salvar na janela pop-up do formulário. No software de planilha, abra o arquivo pp gerado na etapa anterior.
Ajuste o visor de dados clicando em Texto de Dados para Colunas e, em seguida, Delimitado. Clique em Next e selecione Espaço e clique em Concluir. Reformat de modo que apenas valores numéricos permaneçam nas células de planilha selecionando Home Find e Select Replace.
Na caixa de encontrar qual caixa, digite Y casaco igual e deixe a caixa de substituição vazia. Clique em Substituir tudo e, em seguida, em OK. Repita para x casaco igual e para z casaco igual e para corte de casaco maior do que. Na tabela de software de planilha, as linhas correspondem a cada posição e colunas aos dados.
Cole a abundância de metadados e metabólitos apropriados nas colunas de planilha subsequentes. Na coluna raio, digite o tamanho desejado das manchas de amostragem a serem visualizadas no modelo. Determine os valores para o raio empiricamente e salve o arquivo no formato CSV.
Navegue até o software ELI Plot, selecione o Surface e arraste e solte o modelo 3D criado na janela do navegador. Arraste e solte a tabela de recursos criada na mesma janela do navegador. Use a legenda no canto inferior direito para projetar a coluna de dados desejada no modelo 3D.
Selecione consecutivamente cada coluna de dados para avaliar a distribuição deste recurso metabólito no modelo 3D. Esta análise levou a uma tabela de 5.502 características e sua visualização em 3D. Esta abordagem permite a visualização de características metabólicas em animais individuais que são altos no local de alta carga de parasitas, metabólitos com distribuição diferencial entre regiões teciduais e características metabólicas que são encontradas em níveis comparáveis em intestinos pequenos e grandes.
É importante lembrar de usar apenas solventes LCMS e coletar todo o tecido adjacente e extrair os metabólitos para todas as amostras coletadas para evitar lacunas nos mapas espaciais. Esta técnica pode ser usada para explorar os requisitos de nutrientes para a colonização tecidual por parasitas trypanosomatid para entender a patogênese da doença através da comparação de mapas de distribuição metabólica 3D com a infecção.
