Bu protokol, metabolit ve parazit dağılımının 3D modellerini oluşturmak için kullanılabilir. Bu, lokal doku metabolik pertürbasyonu, parazit dağılımı ve klinik hastalık semptomları arasındaki ilişkiyi anlamada yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, patojen dağılımına karşı metabolit dağılımının canlı ölçekli organlar arası haritalanmasını ve istatistiksel analizini sağlamasıdır.
Teorik olarak, kimyasal haritacılık, patogenezden sorumlu metabolitleri ve tedavinin etkilerini doğrudan inceleyerek hastalığın gelişimini ve konakçı üzerindeki etkisini araştırabilir. Tüpleri tartarak ve etiketleyerek başlayın. Dokuları sistematik olarak tüp başına bir bölüm ile kesitleyin.
Numune ağırlığını belirlemek ve ağırlığı kaydetmek için doku örnekleri içeren tüpleri tartın. Doku numunelerinin su bazlı homojenizasyonunu gerçekleştirmek için, doku numuneleri içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine bir adet beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin. LCMS sınıfı su içeren boş bir tüp yapın.
Soğutulmuş LCMS sınıfı su ekleyerek numunenin 50 miligramı başına 500 mikrolitreye kadar hacmi oluşturun, ardından numuneleri üç dakika boyunca 25 hertz'de homojenize edin. Numuneler iyice homojenize edilmelidir. DNA ekstraksiyonu ve diğer analizler için homojenizasyon hacminin 1 / 10'unu toplayın.
Homojenata dört mikromolar sülfakloropiridazin ile çivilenmiş buz gibi soğuk LCMS sınıfı metanol ekleyin. Numuneleri bir doku homojenizatöründe 25 hertz'de üç dakika boyunca homojenize edin, ardından 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın. 96 kuyucuklu bir plakaya eşit miktarda süpernatant toplayın ve süpernatantları toplarken buz üzerinde katı kalıntı tutun.
Sulu ekstraksiyon süpernatantını maksimum hız kullanarak ve ısıtma olmadan tamamen kurutun. 50 miligram katı kalıntı numunesi başına iki mikromolar sülfakloropiridazin ile çivilenmiş 1.000 mikrolitre önceden soğutulmuş diklorometan metanol ekleyerek organik ekstraksiyon gerçekleştirin. Numuneleri beş dakika boyunca 25 hertz'de homojenize edin, ardından 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın.
96 kuyucuklu bir plakaya eşit miktarda süpernatant toplayın. İlgilenilen organın fotoğrafını çekin. İlgilenilen organların bir resmini içe aktarmak için Dosya'ya ve ardından SketchUp yazılımında İçe Aktar'a tıklayın.
Çizgiler aracına tıklayın ve serbest el seçeneğini seçin. İlgilenilen organların ana hatlarını izlemek ve çizmek için kalem aracını kullanın. İtme/çekme aracını seçin ve çizimi 2B'den 3B'ye dönüştürmek için gölgeli alanda yukarı çekin.
Dosya Dışa Aktarma'ya ve ardından 3B modele tıklayarak dosyayı dae biçiminde dışa aktarın. Modelin gerçekçiliğini geliştirmek için Dosya'yı seçip Mesh'i İçe Aktar'a tıklayarak modeli MeshLab yazılımına aktarın. Üst menüden Tel Kafes'i seçin, ardından Filtreler'i seçin, Yeniden Örgüleme Basitleştirme ve Yeniden Yapılandırma'ya ve ardından Alt Bölüm Yüzeyleri Orta Noktası'na tıklayın.
Tüm değerleri varsayılan olarak bırakın ve iki kez Uygula'yı seçin. Dosya'ya, ardından Mesh Farklı Dışa Aktar'a tıklayarak ve ardından dosya türü açılır menüsünden SDL Dosya Biçimi'ni seçerek modeli sdl biçiminde dışa aktarın. Bunu kaydedin ve bir sonraki açılır menüden Tamam'ı seçin.
Meshmixer yazılımını açın ve önceki adımda oluşturulan sdl dosyasını içe aktarın. Yuvarlanması gereken model yüzeylerini çıkarmak için heykel, fırçalar, ejderha heykeli, fırçalar, şişirme araçlarını kullanın. Model istenen görünüme kavuştuğunda Dosya ve Dışa Aktar'a tıklayarak sdl formatında kaydedin.
Dosyayı istediğiniz gibi adlandırın, SDL İkili Biçimi'ni seçin ve kaydedin. 3B modeli MeshLab yazılımında açın. Açık işlem sonrası açılır penceresinde Tamam'a tıklayın.
Seçim noktaları aracını seçerek her örnekleme noktası için X, Y ve Z koordinatlarını elde edin ve ardından 3B model yüzeyinde düzenli aralıklarla sağ tıklayın. İstediğiniz tüm koordinatlar seçildikten sonra, form açılır penceresindeki en üstteki Kaydet düğmesine tıklayın. Elektronik tablo yazılımında, önceki adımda oluşturulan pp dosyasını açın.
Veri Metni'ni Sütunlar'a, ardından Sınırla'ya tıklayarak veri görüntüsünü ayarlayın. İleri'ye tıklayın ve ardından Boşluk'u seçin ve Son'a tıklayın. Ana Sayfa Bul ve Değiştir'i seçerek elektronik tablo hücrelerinde yalnızca sayısal değerler kalacak şekilde yeniden biçimlendirin.
Aranan kutusuna Y eşit kat girin ve değiştir kutusunu boş bırakın. Tümünü Değiştir'e ve ardından Tamam'a tıklayın. X eşit kat ve Z eşit kat ve kat eğik çizgi için daha büyük tekrarlayın. Elektronik tablo yazılım tablosunda, satırlar her konuma ve sütunlar verilere karşılık gelir.
Uygun meta verileri ve metabolit özelliği bolluğunu sonraki e-tablo sütunlarına yapıştırın. Yarıçap sütununa, modelde görselleştirilecek örnekleme noktalarının istenen boyutunu girin. Yarıçap değerlerini ampirik olarak belirleyin ve dosyayı CSV biçiminde kaydedin.
ELI Plot yazılımına gidin, Yüzey'i seçin, ardından oluşturulan 3B modeli tarayıcı penceresine sürükleyip bırakın. Oluşturulan özellik tablosunu aynı tarayıcı penceresine sürükleyip bırakın. İstediğiniz veri sütununu 3B modele yansıtmak için sağ alt köşedeki göstergeyi kullanın.
Bu metabolit özelliğinin 3B modeldeki dağılımını değerlendirmek için her veri sütununu ardışık olarak seçin. Bu analiz, 5.502 özellikten oluşan bir tabloya ve bunların 3D olarak görselleştirilmesine yol açtı. Bu yaklaşım, yüksek parazit yükü bölgesinde yüksek olan bireysel hayvanlarda metabolit özelliklerinin, doku bölgeleri arasında diferansiyel dağılıma sahip metabolitlerin ve ince ve kalın bağırsaklarda karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerinin görselleştirilmesini sağlar.
Sadece LCMS çözücülerini kullanmayı ve tüm bitişik dokuları toplamayı ve uzamsal haritalardaki boşlukları önlemek için toplanan tüm örnekler için metabolitleri çıkarmayı hatırlamak önemlidir. Bu teknik, 3D metabolit dağılım haritalarını enfeksiyon üzerine karşılaştırarak hastalık patogenezini anlamak için Tripanosomatid parazitler tarafından doku kolonizasyonu için besin gereksinimlerini araştırmak için kullanılabilir.
