Этот протокол может быть использован для построения 3D-моделей распределения метаболитов и паразитов. Это может помочь в понимании взаимосвязи между метаболическим возмущением местной ткани, распространением паразитов и клиническими симптомами заболевания. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет осуществлять межорганное картирование распределения метаболитов в реальном масштабе и распределение патогенов и его статистический анализ.
Теоретически, химическая картография может исследовать развитие и влияние заболевания на хозяина, непосредственно изучая метаболиты, ответственные за патогенез и эффекты лечения. Начните с взвешивания и маркировки трубок. Секционирование тканей систематически одним срезом на пробирку.
Взвесьте пробирки, содержащие образцы тканей, чтобы определить вес образца и записать вес. Чтобы выполнить гомогенизацию образцов тканей на водной основе, добавьте один пятимиллиметровый шарик из нержавеющей стали в две миллилитровые микроцентрифужные трубки, содержащие образцы тканей. Сделайте одну заготовку, содержащую воду класса LCMS.
Восполните объем до 500 микролитров на 50 миллиграммов образца, добавив охлажденную воду класса LCMS, а затем гомогенизируйте образцы при 25 герцах в течение трех минут. Образцы должны быть тщательно гомогенизированы. Соберите 1/10 объема гомогенизации для экстракции ДНК и других анализов.
Добавьте к гомогенату ледяной метанол класса LCMS с четырьмя микромолярами сульфахлорпиридазина. Гомогенизируйте образцы в тканевом гомогенизаторе при 25 герцах в течение трех минут с последующим центрифугированием в течение 10 минут. Соберите равный объем супернатанта в плиту из 96 скважин и сохраните твердый остаток на льду при сборе супернатантов.
Полностью высушите водный экстракционный супернатант, используя максимальную скорость и без нагрева. Выполняют органическую экстракцию, добавляя 1000 микролитров предварительно охлажденного дихлорметанового метанола, дополненного двумя микромолярными сульфахлорпиридазинами на 50 миллиграмм твердого остаточного образца. Гомогенизируйте образцы при 25 герцах в течение пяти минут с последующим центрифугированием в течение 10 минут.
Соберите равный объем супернатанта в плиту из 96 скважин. Сфотографируйте интересующий орган. Нажмите «Файл», затем «Импорт» в программном обеспечении SketchUp, чтобы импортировать изображение интересующих органов.
Нажмите на инструмент «Линии» и выберите опцию от руки. Используйте инструмент карандаша, чтобы проследить и нарисовать контуры интересующих органов. Выберите инструмент push/pull и поднимитесь на затененную область, чтобы преобразовать рисунок из 2D в 3D.
Экспортируйте файл в формате dae, нажав на Экспорт файла, а затем 3D-модель. Чтобы улучшить реалистичность модели, импортируйте модель в программное обеспечение MeshLab, выбрав Файл, а затем нажав «Импортировать сетку». Выберите Каркас в верхнем меню, затем выберите Фильтры, щелкните Ремеширование Упрощение и Реконструкция, а затем на Средняя точка поверхностей подразделения.
Оставьте все значения по умолчанию и дважды выберите Применить. Экспортируйте модель в формате SDL, щелкнув Файл, затем Экспортировать сетку как, а затем выбрав Формат файла SDL в раскрывающемся меню тип файлов. Сохраните его и выберите ОК в следующем всплывающем меню.
Откройте программное обеспечение Meshmixer и импортируйте SDL-файл, сгенерированный на предыдущем шаге. Используйте скульптуру, кисти, скульптуру дракона, кисти, надувные инструменты, чтобы вытащить поверхности модели, которые необходимо закруглить. Сохраните его в формате sdl, как только модель будет иметь желаемый внешний вид, нажав «Файл и экспорт».
Присвойте файлу желаемое имя, выберите двоичный формат SDL и сохраните. Откройте 3D-модель в программном обеспечении MeshLab. Нажмите OK во всплывающем окне после открытия обработки.
Получите координаты X, Y и Z для каждого места отбора проб, выбрав инструмент «Точки отбора», а затем щелкните правой кнопкой мыши через регулярные интервалы по всей поверхности 3D-модели. После того, как все нужные координаты выбраны, нажмите на самую верхнюю кнопку Сохранить во всплывающем окне формы. В программном обеспечении для работы с электронными таблицами откройте файл pp, созданный на предыдущем шаге.
Настройте отображение данных, щелкнув Текст данных в столбцах, а затем с разделителями. Нажмите «Далее», затем выберите «Пробел» и нажмите «Готово». Переформатируйте таким образом, чтобы в ячейках электронной таблицы оставались только числовые значения, выбрав «Найти дом» и «Выбрать заменить».
В поле Найти, что нужно, введите Y равное пальто и оставьте поле замены пустым. Нажмите «Заменить все», а затем на «ОК». Повторите для X равного слоя и для Z равного слоя, а для coat slash больше. В таблице программного обеспечения электронной таблицы строки соответствуют каждой позиции, а столбцы — данным.
Вставьте соответствующие метаданные и обилие метаболитов в последующие столбцы электронной таблицы. В столбце радиуса введите желаемый размер пятен выборки, которые будут визуализированы на модели. Определите значения радиуса опытным путем и сохраните файл в формате CSV.
Перейдите к программному обеспечению ELI Plot, выберите Surface, затем перетащите созданную 3D-модель в окно браузера. Перетащите созданную таблицу объектов в то же окно браузера. Используйте легенду в правом нижнем углу для проецирования нужного столбца данных на 3D-модель.
Последовательно выбирайте каждый столбец данных, чтобы оценить распределение этого метаболита на 3D-модели. Этот анализ привел к таблице из 5 502 объектов и их визуализации в 3D. Этот подход позволяет визуализировать особенности метаболитов у отдельных животных, которые находятся на высоком уровне в месте высокой паразитарной нагрузки, метаболиты с дифференциальным распределением по областям ткани и метаболитные особенности, которые обнаруживаются на сопоставимых уровнях в тонком и толстом кишечнике.
Важно помнить об использовании только растворителей LCMS и собирать всю прилегающую ткань и извлекать метаболиты для всех собранных образцов, чтобы избежать пробелов в пространственных картах. Этот метод может быть использован для изучения потребностей в питательных веществах для колонизации тканей паразитами Trypanosomatid, чтобы понять патогенез заболевания путем сравнения 3D-карт распределения метаболитов при инфекции.
