Dieses Protokoll kann verwendet werden, um 3D-Modelle der Metaboliten- und Parasitenverteilung zu erstellen. Dies kann helfen, die Beziehung zwischen lokaler Stoffwechselstörung des Gewebes, Parasitenverteilung und klinischen Krankheitssymptomen zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie eine Live-Skalen-Cross-Organ-Kartierung der Metabolitenverteilung im Vergleich zur Pathogenverteilung und ihre statistische Analyse ermöglicht.
Theoretisch kann die chemische Kartographie die Entwicklung und die Auswirkungen der Krankheit auf den Wirt untersuchen, indem sie die für die Pathogenese verantwortlichen Metaboliten und die Auswirkungen der Behandlung direkt untersucht. Beginnen Sie mit dem Wiegen und Beschriften der Rohre. Schneiden Sie die Gewebe systematisch mit einem Abschnitt pro Röhrchen.
Wiegen Sie die Röhrchen mit Gewebeproben, um das Probengewicht zu bestimmen und das Gewicht aufzuzeichnen. Um eine wasserbasierte Homogenisierung der Gewebeproben durchzuführen, fügen Sie den zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die Gewebeproben enthalten, eine fünf Millimeter große Edelstahlperle hinzu. Stellen Sie ein leeres Rohr her, das Wasser in LCMS-Qualität enthält.
Erhöhen Sie das Volumen auf 500 Mikroliter pro 50 Milligramm der Probe, indem Sie gekühltes LCMS-Wasser hinzufügen, und homogenisieren Sie die Proben dann drei Minuten lang bei 25 Hertz. Die Proben sollten gründlich homogenisiert werden. Sammeln Sie 1/10 des Homogenisierungsvolumens für DNA-Extraktion und andere Analysen.
Fügen Sie dem Homogenat eiskaltes Methanol in LCMS-Qualität hinzu, das mit vier Mikromolar Sulfachlorpyridazin versetzt ist. Homogenisieren Sie die Proben in einem Gewebehomogenisator bei 25 Hertz für drei Minuten, gefolgt von einer Zentrifugation für 10 Minuten. Sammeln Sie ein gleiches Volumen Überstand in eine 96-Well-Platte und halten Sie feste Rückstände auf Eis, während Sie die Überstände sammeln.
Trocknen Sie den wässrigen Extraktionsüberstand vollständig mit maximaler Geschwindigkeit und ohne Erhitzen. Führen Sie eine organische Extraktion durch, indem Sie 1.000 Mikroliter vorgekühltes Dichlormethanmethanol hinzufügen, das mit zwei mikromolaren Sulfachlorpyridazin pro 50 Milligramm fester Rückstandsprobe versetzt ist. Homogenisieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 25 Hertz, gefolgt von einer Zentrifugation für 10 Minuten.
Sammeln Sie ein gleiches Volumen an Überstand in eine 96-Well-Platte. Machen Sie ein Foto von der Orgel von Interesse. Klicken Sie auf Datei und dann in der SketchUp-Software auf Importieren, um ein Bild der interessierenden Organe zu importieren.
Klicken Sie auf das Linienwerkzeug und wählen Sie die Freihandoption. Verwenden Sie das Bleistiftwerkzeug, um die Umrisse der interessierenden Organe zu zeichnen und zu zeichnen. Wählen Sie das Push/Pull-Werkzeug aus und ziehen Sie den schattierten Bereich nach oben, um die Zeichnung von 2D in 3D zu konvertieren.
Exportieren Sie die Datei im dae-Format, indem Sie auf Dateiexport und dann auf 3D-Modell klicken. Um den Realismus des Modells zu verbessern, importieren Sie das Modell in die MeshLab-Software, indem Sie Datei auswählen und dann auf Mesh importieren klicken. Wählen Sie im oberen Menü die Option Drahtmodell (Wireframe) und dann Filter (Filters), klicken Sie auf Remeshing Simplification and Reconstruction (Vernetzung und Rekonstruktion) und dann auf Subdivision Surfaces Midpoint.
Lassen Sie alle Werte als Standardwert, und wählen Sie Zweimal Anwenden aus. Exportieren Sie das Modell im SDL Format, indem Sie auf Datei und dann auf Mesh exportieren als klicken und dann im Dropdown-Menü Dateityp die Option SDL Dateiformat auswählen. Speichern Sie dies und wählen Sie OK im nächsten Popup-Menü.
Öffnen Sie die Meshmixer-Software und importieren Sie die im vorherigen Schritt generierte SDL-Datei. Verwenden Sie die Skulptur, Pinsel, Drachenskulptur, Pinsel, Aufblaswerkzeuge, um die Modelloberflächen herauszuziehen, die abgerundet werden müssen. Speichern Sie es im SDL Format, sobald das Modell das gewünschte Aussehen hat, indem Sie auf Datei und Exportieren klicken.
Benennen Sie die Datei wie gewünscht, wählen Sie das SDL Binärformat aus und speichern Sie sie. Öffnen Sie das 3D-Modell in der MeshLab-Software. Klicken Sie im Popup-Fenster nach dem Öffnen auf OK.
Rufen Sie X-, Y- und Z-Koordinaten für jeden Abtastpunkt ab, indem Sie das Werkzeug "Pickpunkte" auswählen und dann in regelmäßigen Abständen mit der rechten Maustaste über die 3D-Modelloberfläche klicken. Sobald alle gewünschten Koordinaten ausgewählt wurden, klicken Sie auf die oberste Schaltfläche Speichern im Formular-Popup-Fenster. Öffnen Sie in der Tabellenkalkulationssoftware die im vorherigen Schritt generierte pp-Datei.
Passen Sie die Datenanzeige an, indem Sie auf Datentext in Spalten und dann auf Abgegrenzt klicken. Klicken Sie auf Weiter und wählen Sie dann Platz und klicken Sie auf Fertig stellen. Formatieren Sie das Format neu, sodass nur numerische Werte in den Tabellenkalkulationszellen verbleiben, indem Sie Home-Suchen und Ersetzen auswählen.
Geben Sie im Feld Suchen nach die Zeichenfolge Y equal coat ein und lassen Sie das Feld zum Ersetzen leer. Klicken Sie auf Alle ersetzen und dann auf OK. Wiederholen Sie den Vorgang für X gleiche Schicht und für Z gleiche Schicht und für Strich größer als. In der Tabellenkalkulationssoftwaretabelle entsprechen Zeilen jeder Position und Spalten Daten.
Fügen Sie die entsprechenden Metadaten und die Häufigkeit der Metabolitenfunktionen in die nachfolgenden Tabellenkalkulationsspalten ein. Geben Sie in der Spalte Radius die gewünschte Größe der Probenahmepunkte ein, die auf dem Modell visualisiert werden sollen. Ermitteln Sie die Werte für den Radius empirisch und speichern Sie die Datei im CSV-Format.
Wählen Sie nacheinander jede Datenspalte aus, um die Verteilung dieses Metabolitenmerkmals im 3D-Modell zu bewerten. Diese Analyse führte zu einer Tabelle mit 5.502 Features und deren Visualisierung in 3D. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung von Metabolitenmerkmalen bei einzelnen Tieren, die an der Stelle hoher Parasitenbelastung hoch sind, von Metaboliten mit differentieller Verteilung über Geweberegionen und von Metabolitenmerkmalen, die in vergleichbaren Mengen im Dünn- und Dickdarm gefunden werden.
Es ist wichtig, daran zu denken, nur LCMS-Lösungsmittel zu verwenden und das gesamte angrenzende Gewebe zu sammeln und die Metaboliten für alle gesammelten Proben zu extrahieren, um Lücken in räumlichen Karten zu vermeiden. Diese Technik kann verwendet werden, um den Nährstoffbedarf für die Gewebebesiedlung durch Trypanosomatidenparasiten zu untersuchen, um die Krankheitspathogenese durch den Vergleich von 3D-Metabolitenverteilungskarten nach der Infektion zu verstehen.
