Os protocolos para a cultura dos organoides hepáticos e intestinais caninos são importantes para padronizar essa nova tecnologia. Esta técnica permite o estabelecimento confiável e reprodutível da cultura organoide canina, incluindo o isolamento organoide, manutenção, colheita e biobanco subsequente de amostras. Os organoides caninos podem fornecer um excelente modelo para inúmeras aplicações que abrangem desde biologia, desenvolvimento de doenças infecciosas, testes e descobertas de drogas, e também medicina de transmissão.
Para começar, prepare cinco tubos de centrífugas de 15 mililitros com cinco mililitros de solução de quelação completa 1X, um tubo com três mililitros de solução de quelação completa 1X, um tubo vazio e um tubo com cinco mililitros de solução de quelação completa 1X, e dois mililitros de soro bovino fetal. No dia do isolamento, coloque uma placa de Petri estéril, bisturi, balde de gelo e mistura de nutrientes DMEM avançado a frio F12 no armário de biossegurança. Coloque o número necessário de placa de cultura celular de 24 poços na incubadora de dióxido de carbono para pré-aquecer.
Coloque a matriz de membrana extracelular solubilizada no gelo para descongelar. Pré-arrefeça a centrífuga a quatro graus Celsius. Mova a mídia completa com fatores de crescimento do congelador para um banho de água de 37 graus Celsius evitando exposição direta à luz.
Agite amostras de tecido no tubo de transporte por 30 segundos. Remova o supernanato excessivo sem descartar nenhum tecido por tubulação lenta perto da superfície do fluido até que 0,5 mililitros seja deixado no tubo. Transfira tecido e remanescente de supernante para uma placa de Petri estéril.
Usando um bisturi descartável, corte e pique o tecido em pedaços menores, assemelhando-se a uma consistência de purê por aproximadamente cinco minutos. Pipeta o tecido picado com líquido da placa de Petri para o primeiro tubo completo de solução de quelação, em seguida, adicione dois mililitros de mistura avançada de nutrientes DMEM F12 à placa de Petri. Lave o tecido restante e transfira para o primeiro tubo completo de solução de quelação.
Vórtice o tubo de solução de quelação completa 1X aproximadamente cinco vezes por cinco segundos. Permita que as biópsias se instalem na parte inferior do tubo por um minuto e remova o sobrenatante até que cinco mililitros fiquem. Transfira a solução de quelação completa 1X do novo tubo para o tubo de amostra.
Repita a etapa anterior para os dois tubos seguintes. E nas duas últimas lavagens, remova o supernatante até três mililitros restantes no tubo. Transfira as biópsias e a solução de quelação completa 1X do tubo de amostra para um poço de uma placa de seis poços.
Adicione três mililitros de solução completa de quelação 1X ao tubo de amostra. Gire suavemente para coletar qualquer tecido restante e transferir para o mesmo poço da placa. Adicione 150 microliters de 0,5 molar diamina tetraacética em um poço e coloque a placa de seis poços em um roqueiro de 20 graus 24 RPM a quatro graus Celsius.
Incubar as amostras de fígado por 10 minutos e as amostras intestinais por uma hora no roqueiro em movimento. Transporte a placa de seis poços de volta para o armário de biossegurança e transfira o tecido picado e o líquido para um tubo contendo solução de quelação completa 1X com soro bovino fetal. Deixe os tecidos se instalarem e transportar o supernasal com 0,2 mililitros da porção superior do tecido para um tubo vazio.
Gire o tubo contendo a amostra a 700 XG por cinco minutos a quatro graus Celsius. As células-tronco são agora pelotas junto com o tecido picado. Retire e descarte o supernatante cuidadosamente para não perturbar a pelota.
Resuspense a pelota em DMEM F12 avançado. Gire o tubo novamente e aspire o sobrenante sem perturbar a pelota. Adicione o volume calculado da matriz de membrana extracelular solubilizada ao tubo amostral.
Tenha cuidado ao remover a mídia para não perder a pelota celular. Ao adicionar uma matriz de membrana extracelular, a pipeta lentamente para não criar bolhas excessivas na suspensão organoide. Mantenha a amostra com a matriz de membrana extracelular solubilizada no gelo e semee a suspensão no meio dos poços para que a matriz de membrana extracelular solubilizada forme uma estrutura semelhante a uma cúpula.
Transporte a placa para uma incubadora e deixe que a matriz de membrana extracelular solubilizada se solidifique por 30 minutos. Misture o inibidor ROCK e o beta GSK3 em mídia completa com fatores de crescimento e adicione 500 microliters desta solução a cada poço. Coloque a placa na incubadora.
O protocolo organoide canino normalmente gera aproximadamente 50.000 a 150.000 células intestinais ou hepáticas por poço. Após o isolamento das células-tronco, organoides caninos hepáticos iniciam seu ciclo de vida como esferoides em expansão, e após sete dias, eles se transformam em organoides brotantes e diferenciadores. Foram calculados o volume, a área de superfície, a elipse 2D e a circunferência dos esferoides.
Área de elipse 2D e circunferência foram utilizadas para avaliar a saúde da cultura organoide. A avaliação da expressão dos marcadores de forma semi-quantitativa mostrou que os esferoides expressaram preferencialmente o marcador de cholangiocito KRT7 variando de um a 26%A expressão LGR5 marcador de célula-tronco variou entre 0,17 e 0,7 8% enquanto os marcadores de hepatócito foram expressos em menor medida em 0,05 a 0,34% para caixa forkhead 1A e 0,03 a 0,28% para citocromo-P450. Uma incubação de 12 minutos com protease semelhante à trippsina não inibiu o crescimento organoide.
No entanto, o crescimento dos organoides foi impactado negativamente por meio de uma incubação de 24 minutos. A sobrevivência dos organoides hepáticos caninos em um ambiente desfavorável foi analisada para determinar o volume de mídia organoide e matriz de porão necessária para o crescimento e sobrevivência dos organoides hepáticos. A taxa de sobrevivência dos organoides variou de 12,9 dias a 18 dias.
Técnicas básicas de cultura celular e abordagens assépticas são os pré-requisitos essenciais para o isolamento e manutenção organoides adequados.
