Este método gera uma impressão de dedo cardiolipin de leucócitos por espectrometria de massa MALDI-TOF e permite a medição da razão entre monolysocardiolipina e cardiolipina para um diagnóstico rápido da síndrome de Barth. A principal vantagem desta técnica é a detecção de espécies lipídicas diagnósticas por uma única rodada de espectrometria de massa imediatamente após o isolamento de leucócitos de um mililitro de sangue. Estes e a sensibilidade e especificidade dos olhos fazem deste ensaio um teste diagnóstico adequado para ser integrado ao trabalho rotineiro dos laboratórios clínicos para a triagem da síndrome de Barth.
Comece colocando amostras de sangue em um agitador orbital por 10 minutos. Em seguida, a 0,9 mililitros de sangue inteiro em um tubo de 1,5 mililitro, adicione 0,1 mililitros de 20% dextran. Agora pipeta e disperse a suspensão suavemente 20 vezes, evitando bolhas de ar e deixe os RBCs sedimentares por cerca de uma hora em temperatura ambiente.
Usando uma seringa, colete e transfira o supernatante amarelo para um tubo de 15 mililitros e, em seguida, centrífuga a 400 vezes G por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de descartar o supernatante, resuspenque a pelota contendo principalmente leucócitos e RBCs residuais em 0,6 mililitros de água dupla destilada gelada. Após aproximadamente 15 segundos, adicione 0,2 mililitros de cloreto de potássio molar de 0,6 molar à suspensão celular para restaurar a osmolaridade correta.
O curto choque osmótico vai lise RBC e deixar leucócitos intactos. Em seguida, ajuste o volume final para 2,5 mililitros com PBS de força única. Em seguida, centrifugar a suspensão a 400 vezes G por 15 minutos em temperatura ambiente.
Isso é seguido por descartar o supernasce e relavar a pelota de leucócito com 2,5 mililitros de PBS de força única. Repita a centrífuga e descarte o supernatário como descrito anteriormente e resuspenja a pelota contendo leucócitos em 200 microliters de água dupla destilada esterilizada. Congele a suspensão a menos 80 graus Celsius ou realize diretamente a extração lipídica.
Inicie a extração transferindo 20 microlitadores de suspensão de leucócitos para um tubo de 1,5 mililitro e gire a 16.000 vezes G por 30 segundos. Depois de descartar o supernascer, adicione 10 microlitadores de clorofórmio à pelota restante e pipeta repetidamente para promover a extração lipídica. Agora, adicione 10 microlitadores de solução de matriz de 9-aminoacridina à pelota em clorofórmio.
Pipeta e dispersar repetidamente para misturar. Gire a solução contendo lipídios e clorofórmio e solução de matriz de 9-aminoacridina a 16.000 vezes G durante 30 segundos. Por fim, deposite o supernaente como gotículas de 0,35 microliters na meta maldi a ser analisada e deixe as gotículas secarem pelo menos por 10 a 15 minutos.
Para análise lipídica, adquira espectros de massa de amostras em triplicados em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Após a calibração com padrões lipídes, defina as análises no modo íon negativo e otimize a relação massa-carga de detecção de 200 thomson a 2.000 thomson para análise de pequenas moléculas. Mantenha a fluência de laser 5% acima do limiar para ter uma boa relação sinal-ruído.
Para cada espectro de massa, aplique uma média de 2.000 tiros a laser únicos. Adquira espectro no modo refletor usando extração pulsada retardada. Aplique suspensão de matriz fechada a 400 thomson para evitar a saturação do detector.
A figura mostra que os defeitos no gene TAFAZZIN tipicamente determinam um perfil lipídeco específico da síndrome de Barth indicado pelo aparecimento de formas monolysocardiolipina e cardiolipina imatura, juntamente com a redução de formas de cardiolipina maduras na impressão digital da cardiolipina. Além disso, a figura também mostra que as análises maldi-TOF/MS de leucócitos de sujeitos de controle normalmente exibem apenas duas espécies de cardiolipina madura. A figura mostra que monolysocardiolipin mais cardiolipina imatura na razão cardiolipina madura para pacientes com síndrome de Barth foi maior do que para indivíduos saudáveis e pacientes com insuficiência cardíaca.
Aqui, os grupos de controle e os pacientes com síndrome de Barth são separados por mais de uma ordem de magnitude, mostrando que este método tem uma forte capacidade diagnóstica para a síndrome de Barth. Para garantir um bom resultado de ensaio, é crucial seguir cuidadosamente todos os passos do protocolo desde o isolamento dos leucócitos até o cálculo da razão mono-monosocardiolipina-cardiolipina. A espectrometria de massa MALDI-TOF é útil para a obtenção de perfis lipídicos de pequenas quantidades de várias amostras biológicas para identificar biomarcadores lipídicos ou alterações patológicas.
