Esses protocolos permitem que os pesquisadores vão além de simplesmente medir o consumo de oxigênio mitocondrial e, em vez disso, permitem a medição dos principais produtos finais mitocondriais, ATP e espécies reativas de oxigênio. A principal vantagem dessa técnica é que o investigador pode medir a eficiência mitocondrial comparando diretamente a taxa de consumo de oxigênio com a taxa de produção do produto final. Se o produto final é ATP ou oxigênio reativo.
As técnicas exigem muita atenção aos detalhes, principalmente para evitar bolhas. Seja na câmara de respiração ou nas seringas de titulação, as bolhas são inimigas porque tornam as medições menos precisas. Após a obtenção das biópsias do músculo esquelético.
Encha as câmaras do respirômetro com meio livre de magnésio e sele a câmara de incubação. Ajuste a temperatura de incubação do instrumento para 38 graus Celsius para representar a temperatura basal do músculo esquelético equino. E ajuste a mistura do meio de respiração para 750 rpm usando uma agitação magnética girando no fundo da câmara do respirômetro.
Em seguida, desligue a iluminação da câmara para evitar interferência com sensores fluorescentes. Energize o eletrodo de oxigênio com uma tensão de polarização de 800 milivolts e amplifice o sinal resultante com uma configuração de ganho de um. Registre a concentração de oxigênio a cada dois segundos e calcule o fluxo de oxigênio como a inclinação negativa da medição de oxigênio ao longo dos 40 segundos seguintes.
Em seguida, calibre o sensor de oxigênio, permitindo que a mídia se equilibre com o ar ambiente. Calcular a pressão parcial de oxigênio de referência com base na pressão barométrica medida pelo respirômetro de alta resolução e na concentração padrão de oxigênio atmosférico. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.
Energize os sensores em 400 a 500 milivolts e o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 a 1.000. Em seguida, adicione TMRM à câmara de respiração antes de adicionar mitocôndrias e calibre o sinal fluorescente usando uma calibração simples de dois pontos do sinal fluorescente versus a quantidade de fluoróforo adicionado antes da adição da mitocôndria. Realizar a calibração final do sinal TMRM após a conclusão do protocolo de titulação da respirometria, fornecendo várias titulações de agente desacoplador até que nenhum novo aumento no sinal fluorescente TMRM seja observado indicando o colapso completo do potencial de membrana mitocondrial.
Use sensores fluorescentes azuis para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração e energize esses sensores para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor. Adicione oito microlitros de EDTA de dois milimolares à câmara respiratória para quelar cátions que competiriam com íons de magnésio para se ligarem ao verde de magnésio. Em seguida, adicione quatro microlitros de um milimolar verde de magnésio à câmara de respiração.
Calibrar o sinal fluorescente bruto com titulações sequenciais de 10 por 2 microlitros de cloreto de magnésio de 100 milimolares, permitindo um minuto entre as titulações para estabilizar o sinal fluorescente. Determine a taxa de síntese de ATTP que é a inclinação da concentração de ATP ao longo do tempo ao longo do protocolo. Use sensores fluorescentes verdes para quantificar o sinal fluorescente da câmara de respiração.
Energize os sensores em 300 a 400 milivolts. E o sinal resultante é amplificado com um ganho de 1 para 1.000. Otimize configurações específicas para instrumentos individuais para capturar o sinal esperado dentro da faixa linear do sensor.
Antes de adicionar as mitocôndrias realize a configuração química e calibração inicial do Amplex UltraRed Assay. Adicionar 30 micromoles de DTPA aos cátions quelados que possam interferir com a reação. Em seguida, adicione superóxido dismutase ou serratus peroxidase e Amplex UltraRed na câmara de respirometria.
Deixe o sinal fluorescente estabilizar. Em seguida, adicione 0,2 micromoles de peróxido de hidrogênio duas vezes com um intervalo de cinco minutos. Realizar calibrações adicionais de dois pontos ao longo do ensaio para permitir o ajuste da capacidade de resposta do ensaio à medida que a química da respirometria muda ao longo do ensaio com o tempo específico desses pontos de calibração a critério do investigador.
Vórtice a amostra para manter uma suspensão uniforme da amostra e adicionar 15 microlitros de suspensão mitocondrial isolada a cada câmara de incubação de dois mililitros para que os resultados representem o rendimento mitocondrial de 18,75 miligramas de músculo. Antes de adicionar qualquer substrato, meça o consumo residual de oxigênio e subtraia esse valor dos valores de consumo de oxigênio de cada etapa da titulação do inibidor desacoplado do substrato ou do protocolo SUIT após o preenchimento. Utilizar um SUIT de uso geral que permita a caracterização inicial da função mitocondrial do músculo esquelético equino.
Comece com titulações sequenciais de piruvato, glutamato e malato uns nos outros em cada câmara para produzir nicotinamida adenina dinucleotídeo e estimular a respiração não fosforilante suportada por NADH oxidado através de vazamento complexo de uma base. Em seguida, adicione ADP para estimular a respiração fosforilante através da respiração fosforilante complexa. Adicione succinato para produzir respiração fosforilante combinando respiração fosforilante complexa um e respiração fosforilante complexa dois Adicione rotenona para bloquear o complexo um.
O fluxo de oxigênio resultante representa a capacidade do complexo dois de suportar o consumo de oxigênio mitocondrial pela oxidação isolada do succinato. Um traço respiratório de alta resolução da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e do potencial relativo de membrana é mostrado. Os valores respiratórios das mitocôndrias incubadas com TMRM são menores devido a um efeito inibitório desse fluoróforo.
A respiração mitocondrial e a síntese de ATTP do músculo esquelético equino contendo uma alta porcentagem de fibras musculares esqueléticas tipo um ricas em mitocôndrias e incubadas sob condições que aproximam o metabolismo de repouso são mostradas. O traço respiratório da respiração mitocondrial do músculo esquelético equino e a produção de peróxido de hidrogênio são mostrados. A respirometria de alta resolução requer muita paciência.
A pessoa que executa o ensaio terá vários pontos de tempo em que precisa fazer uma chamada de julgamento sobre se um estado estacionário foi alcançado e o próximo passo pode ocorrer. Demonstramos apenas um único protocolo de titulação. Existem dezenas de outros protocolos que podem ser aplicados da mesma forma para abordar questões específicas sobre o metabolismo mitocondrial.
