Uma das principais limitações da microscopia de expansão é que a fluorescência diminui após a polimerização e digestão. A microscopia de expansão de retenção de etiquetas, que chamamos de LR-ExM, utiliza âncoras trifuncionais, que são de modo a polimerização e digestão. Depois de usarmos a âncora de função tri, introduzimos a fluorescência após a etapa de expansão.
Assim, mantemos uma boa relação sinal-ruído enquanto temos uma alta resolução. A microscopia de expansão de retenção de etiqueta pode ser combinada com quaisquer outras microscopias de expansão introduzidas anteriormente e também microscopias fluorescentes. É muito robusto no método versátil.
E para imagens de alta regulação, é realmente importante ter um sinal aprimorado. Para começar, as células de cultura em um vidro de cobertura de câmara de 16 bem removíveis com meio completo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as contagens de células atingirem aproximadamente 40.000, fixe as células com 100 microlitros de PFA a 3,2% em tampão PEM por 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, permeabilizar as células com os 100 microlitros de tampão de permeablização à temperatura ambiente por 15 minutos. Incubar as células com a solução de estreptavidina diluída em um tampão de bloqueio celular por 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, enxaguar brevemente com 200 microlitros de tampão de bloqueio celular. Em seguida, incubar células com 100 microlitros de solução de biotina diluída em um tampão de bloqueio celular por 15 minutos à temperatura ambiente.
Posteriormente, incubar células com 100 microlitros de solução de anticorpos primários contendo anticorpo anti alfa tubulina de rato e anticorpo de cadeia pesada anti-clatrina de coelho por 16 horas a quatro graus Celsius ou uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, incubar as células com 100 microlitros de solução de anticorpos secundários contendo âncoras trifuncionais, burro anti coelho cavar MA e burro anti biotina de rato MA por uma hora à temperatura ambiente. Incubar células com 100 microlitros de 0,25%Glutaraldeído por 15 minutos à temperatura ambiente A fim de ancorar as proteínas no hidrogel.
Remova a estrutura superior da placa de 16 poços com a lâmina de barbear ou qualquer ferramenta de remoção de escolha e mantenha o vidro da tampa inferior. Coloque o copo da tampa em uma placa de Petri e coloque-os no gelo. Adicione 45 microlitros uma solução de monômero a cada poço para condicionar as células.
Incube no gelo por cinco minutos. Para fazer a solução de gelificação, prepare um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Misture monômero, água destilada dupla e 10% T med.
Não adicione o amónio por sulfato ainda. Enquanto isso, mantenha o tubo de solução de gelificação no gelo. Adicionar persulfato de amónio a 10% à solução de gelificação.
Pipete imediatamente 40 microlitros de solução de gelificação em cada poço enquanto armazena um tubo de solução de gelificação no gelo. Coloque a placa do poço no gelo por mais três minutos. Para manter a umidade do gel durante a incubação de 37 graus Celsius, cobriu a placa de Petri com a tampa e colocou algumas gotas de água na placa de Petri.
Enquanto protege a amostra da luz, mova o vidro da tampa e a placa de Petri de 10 centímetros para uma incubadora de 37 graus Celsius por 1,5 horas para gelificação. Após a gelificação, corte o vidro da tampa para separar cada gel. Transfira géis para seis placas de poço.
Adicione dois mililitros de tampão de digestão a cada poço. Deixe as amostras durante a noite à temperatura ambiente ou por quatro horas a 37 graus Celsius. Em seguida, lave os géis com pelo menos 10 vezes o excesso de volume de água do que o volume final do gel enquanto repete a etapa de lavagem quatro vezes por 20 a 30 minutos de cada vez, e o gel se expande em cerca de quatro vezes em cada dimensão.
Incubar géis em volume de dois mililitros de tampão de coloração de estreptavidina digoxigenina com corante de estreptavidina de dois a cinco micromolares e/ou corante antidigoxigenina durante 24 horas à temperatura ambiente, mantendo as amostras no escuro. Em seguida, lave e expanda o gel duas a quatro vezes com excesso de água. Cada lavagem leva cerca de 30 minutos a uma hora.
Para facilitar a visualização das células sob microscopia fluorescente, core as células com DAPI durante a terceira lavagem. Diluir o estoque de DAPI em um a 5.000 delírios em água de lavagem. Incubar o gel com uma solução DAPI por 30 minutos a uma hora.
Em seguida, lave mais duas vezes com três mililitros de água. Revestir a câmara de imagem de fundo de vidro de seis poços com três mililitros de polilisina a 0,01% para imobilizar as amostras de gel. Em seguida, transfira amostras de gel para a câmara de imagem codificada e visualize as amostras com quaisquer escopos de fluorescência desejados.
A microscopia de expansão de retenção de rótulo mostra maior marcação de fluorescência em comparação com a microscopia de expansão de retenção de proteína ou amostras de microscopia de expansão de biotina. A microscopia de expansão de retenção de rótulo mostra um sinal de fluorescência cerca de seis vezes maior em comparação com a microscopia de expansão de retenção de proteína. O LR-ExM pode efetivamente capturar pequenas estruturas, como poços revestidos de clatrina com resolução de limite de subdefração.
Microtúbulos e poços revestidos de clatrina foram corantes co-imunológicas usando âncoras funcionais, escavação NHS MA e biotina NHS MA. Da mesma forma, poços revestidos de clatrina e mitocôndrias foram marcados usando uma abordagem enzimática de etiqueta de proteína com âncoras trifuncionais, como biotina BG MA e cavada BC MA. Além disso, a abordagem baseada em imunocoloração e a abordagem enzimática de etiqueta proteica são combinadas para mostrar a estrutura da lamina A / C e do complexo nucleóporo.
A microscopia de expansão de retenção de rótulo foi realizada no tecido cerebral do camundongo por coloração co-imunológica do marcador pré-sináptico, fagote, e marcador pós-sináptico, Homer 1. Os dois rótulos eram claros e bem separados, o que suporta alta resolução e eficiência de rotulagem. A microscopia de expansão de retenção de mão de obra é um método versátil e robusto, que pode ser combinado com qualquer outra microscopia de expansão introduzida anteriormente.
Para imagens de alta resolução, é importante alcançar uma boa eficiência de rotulagem para capturar melhor a estrutura da escala molecular. A microscopia de expansão de retenção de mão de obra é um método eficaz e robusto para melhorar o sinal.
