Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Douglas Goetz (Departamento de Engenharia Química e Biomolecular da Universidade Ohio) e Dr. Fabian Benencia (Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade Ohio) para discussões criteriosas e revisão do manuscrito. Agradecemos também o Dr. Christopher Huppenbauer para discussões úteis técnicas (W. Nuhsbaum Inc.). Este trabalho foi financiado por concessões do National Science Foundation (CBET-1106118) e os Institutos Nacionais de Saúde (1R15CA161830-01).

1. Instalação de Software <ol><li> Compre StreamPix 5 software multi-câmera com módulo SimulPix ou outro software de imagem capaz de coletar e combinar imagens captadas por câmeras CCD monocromática. </li><li> Os requisitos mínimos para StreamPix 5 incluem: Um PC equipado com Core 2 Duo com 2.4 GHz ou superior, com 2 GB de RAM ou superior. Uma câmera digital ou analógico IEEE apoiado e compatível placa de captura. O Windows XP/7/Vista 32 ou 64 bits. Um monitor com suporte para resolução 1024 x 768 ou superior. Um adaptador gráfico com bom desempenho 2D (OCU Express 16x ou melhor é recomendado) e 7.200 RPM disco rígido para gravar com configuração RAID-O. </li></ol> 2. Instalação de sistema de câmera dupla capaz de duas cores simultâneas em tempo Real Imaging <ol><li> Conecte o divisor DC2 Photometrics emissão, ou semelhante dispositivo câmera dupla divisão de emissões, ao microscópio, deslizando o adaptador DC2 C-mount na porta de vídeo do microscope de tal modo que a carcaça da dicróico no dispositivo é acessível. </li><li> Insira duas câmeras CCD monocromático em fêmea de montagem C 1 e C-mount fêmea 2. Câmeras idênticas são preferíveis. Câmaras similares podem ser utilizados, mas a compatibilidade depende do hardware interno, o mais importante o sensor de imagem CCD. </li><li> Use software de imagem para exibir imagens de ambas as câmaras. Os passos seguintes (2.3.1 - 2.3.4) aplicam-se a StreamPix 5 com módulo SimulPix e deve ser adaptada para outro software de imagem multi-câmera. <ol><li> Abrir StreamPix 5 e selecione &quot;espaço de trabalho&quot; na fita tarefa. </li><li> Abrir &quot;gerente da área de trabalho&quot;, localizada na extremidade direita da tela e selecione &quot;novo espaço de trabalho&quot;. </li><li> Depois de nomear uma câmera, siga software pede para selecionar um capturador de uma lista pré-preenchida. Selecione o grabber combinando o modelo da câmera e repita para o segundo espaço de trabalho da câmara. Para a área de trabalho mesclado, repito mais uma vez, mas &quot;todas as câmeras estão em uso&quot; erro mENSAGEM aparecerá. Esta mensagem é normal. </li><li> Uma vez que o espaço de trabalho resultante da fusão é carregado, atribuir câmeras de espaço de trabalho um espaço de trabalho e 2 para o espaço de trabalho incorporada no painel de encaixe localizado no lado direito do ecrã de visualização. </li></ol></li><li> Alinhe as câmeras no sistema de separação, emissão câmera dual. <ol><li> Alinhar as câmaras em campo brilhante ou de contraste de fase com a grelha de calibração fornecidas pelo fabricante, utilizando uma objectiva 40X PlanApo (ou maior). </li><li> Enviar luz para as oculares do microscópio, coloque a grelha de calibração revestido de metal que foi fornecida pelo fabricante no palco microscópio e Praça da grade no palco microscópio. </li><li> Traga a grade em foco. </li><li> Deslocar, mas não remova, o alojamento dicróica para alinhar a câmera 1 (câmera manual). Exibir a grade sem binning e sem autoscaling. Foque a imagem usando o botão de ajuste de foco no porta C-mount 1. </li><li> Empurrar a caixa para o duplo dicróico Circuitosl dispositivo de aquisição totalmente, de modo que a imagem é dividida pelo dicróico para ambas as câmaras. </li><li> Solte os três 5/64 &quot;set parafusos e gire a segunda câmera na fêmea de montagem C 2 até que a orientação da rede é idêntico em ambas as imagens. Usando o botão de ajuste do foco em C-mount porta 2, trazer a imagem da câmera 2 em foco. </li><li> Finalize o alinhamento usando a imagem combinada no espaço de trabalho resultante da fusão do software de imagem. Isto permite que se veja uma pseudo sobreposição em tempo real das duas imagens da grelha de calibragem. Ajustar a posição da imagem combinados utilizando apenas o botão R / L, no lado direito da DC2. Ajuste este botão até que limite vertical direita / esquerda das imagens é precisamente alinhadas. </li><li> Use o botão L / D para ajustar o alinhamento up / down da segunda imagem até que as barras da grade horizontal estão devidamente alinhados. </li><li> Se durante o alinhamento para cima / baixo uma ligeira rotação da câmera ocorre, corrigir este problema, soltando os três 5/64 &quot;polegadas screws para câmera de 2 e gire até que a imagem exibida está bem alinhada. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de células de câncer de placas paralelas de fluxo Câmara Adesão Assay <ol><li> Culturas células BT-20 do cancro da mama em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com meio completo com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C e 5,0% de CO 2, como descrito anteriormente 2. </li><li> Células de câncer de colheita com um tratamento diluída tripsina e contagem de células com um hemocitômetro. </li><li> Lavar e suspender as células em 10 7 células / ml em 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) em DPBS com cálcio e magnésio (DPBS +). </li><li> Dilui-se os anticorpos primários, ratinho purificada CD24 anti-humano e de rato purificada HECA-452 (anti-antigénios sialofucosylated), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 minutos 9, 10. </li><li> Células centrifugar a 1.200 rpm para obter um pellet de células. Aspiclassificar o anticorpo primário, e lavar as células duas vezes com 0,1% de BSA DBPS +. </li><li> Dilui-se anticorpos secundários, de cabra anti-IgG de ratinho AlexaFluor 568 (emissão máxima, 603 nm), e de cabra anti-IgM de rato AlexaFluor 488 (emissão máxima, 519 nm), a uma concentração óptima predeterminada de 0,1% BSA DPBS +. Incubar as células durante 30 min. </li><li> Lave as células duas vezes e suspensão em 0,1% de BSA DPBS + a 10 6 células / ml em 0,1% BSA DPBS +. </li></ol> 4. Preparação de Reactive Substrato para Placa Paralela Fluxo Câmara Adesão Assay <ol><li> Conectar dois comprimentos separados de tubo para as portas de entrada e de saída da câmara de fluxo de placas paralelas que se encaixa dentro de 35 mm de cultura de tecidos prato. Um tubo vai ligar ao reservatório de células marcadas em suspensão em 0,1% de BSA DPBS + e o outro para a bomba de seringa, que irá retirar o fluido a uma taxa de fluxo especificada. </li><li> Ligar uma linha de vácuo para a câmara de fluxo 1. </li><li> Posicione a câmara de fluxo ao longo de 35 mm de cultura de tecidos dish contendo uma monocamada de células de ovário de hamster chinês que expressam E-selectina (CHO-E). As células CHO-E foram cultivadas em meio completo MEM a 37 ° C e 5,0% de CO 2 2. </li><li> Ajustar a câmara de fluxo e / ou junta câmara de fluxo para assegurar um selo de vácuo adequada 1. </li><li> Retire fluido do reservatório, monitoramento da montagem de câmara de fluxo para vedação adequada e nenhuma evidência visual de formação de bolhas de ar 1. </li><li> Coloque o conjunto câmara de fluxo em microscópio (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Duas cores Aquisição de Imagem <ol><li> Poder fonte Leica EL-6000 luz compacta, ou dispositivo similar, para gerar luz de alta intensidade e par-a em um guia de luz. Use um microscópio invertido para passar esta luz através de um filtro de combinação do cubo, ou seja, G / R (verde / vermelho) cubo de filtro, para excitar fluoróforos de uma cor / intensidade desejada. </li><li> Certifique-se de habitação dicróica está na posição correcta de funcionamento (deprimido) enão está no modo manual. </li><li> Operar microscópio de fluorescência no modo e selecionar adequada cubo de filtro de fluorescência (verde / vermelho). </li><li> Determinar o tempo de exposição e ganho de câmera 1 (vermelho, 620 ± 60 nm) e câmera de 2 (verde; 535 ± 40 nm). <ol><li> Pressione a dicróica para obter imagens em ambos os canais de emissão de vermelho e verde. Usar um ensaio de câmara de fluxo com células marcadas com apenas o fluoróforo vermelho, e obter uma imagem no canal vermelho, ajustando o tempo de exposição da câmara 1 em &quot;configurações vivo&quot; do software de imagem. </li><li> Combine o tempo de exposição de 2 a câmera o tempo de exposição da câmera 1. Se uma imagem é observada no canal verde, artefactos de purga estão presentes e tempo de exposição, em ambas as câmaras tem de ser reduzida. </li><li> Manter o tempo de exposição equivalente em câmera 1 e câmera de 2, reduzir o tempo de exposição até que o artefato de sangria-through não é mais visível no canal verde. Ajuste o ganho da câmera 1 para melhorar a imagem visibility no canal vermelho, se necessário. </li><li> Repita os passos 5.4.1 - 5.4.3 com células marcadas apenas com o fluoróforo verde, mas definir o tempo de exposição com a câmera de 2 a células de imagem no canal verde, sem artefatos sangram-through no canal vermelho coletadas pela câmera 1. </li><li> Anticorpos Retitrate se artefatos sangram-through não podem ser eliminados 11, ou se os tempos de exposição da câmera e uma câmera de 2 são substancialmente diferentes de tal forma que se fundiu imagens podem ser temporariamente desalinhado. </li></ol></li><li> Use um software de imagem para visualizar as imagens capturadas simultaneamente a partir de duas câmeras CCD monocromático no experimento câmara de fluxo. </li><li> Mesclar imagens recolhidas a partir de ambas as câmaras, utilizando o módulo de SimulPix Streampix 5 ou um pacote de software alternativo. </li><li> Use ajustes de correção digitais em SimulPix ou software alternativo para alinhar espacialmente as imagens incorporadas, se necessário. As imagens podem ser corrigidos com o módulo SimulPix para horizontal, verticale ajustes de rotação. </li></ol>

<ol>
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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O sistema de separação de emissão de câmara dupla tem a resolução espacial, temporal e óptica necessária para capturar imagens de alta qualidade em aplicações onde a célula ou o movimento molecular é rápido. Em gerando os resultados representativos, os parâmetros do sistema de separação de emissão de câmara dupla, incluindo as configurações de software e as configurações da câmera, foram otimizados para obter uma sequência imagem mesclada em que rolamento e as células aderentes foram espacialmen...

Os métodos para análise de moléculas na superfície das células, tais como a imunocoloração, empregam sondas que são quimicamente conjugados com fluoróforos, permitindo a detecção de moléculas alvo. Imagens de células vivas e ensaios de adesão de células baseadas no fluxo hidrodinâmicas são gravadas com câmeras CCD monocromático projetado para capturar os processos fisiológicos a nível celular e / ou molecular 1, 2. Essas câmeras são altamente sensíveis, entregar taxas de quadro rápidas (mais de 30 quadros por segundo), e fornecer resolução temporal excepcional (devido a taxas de quadro rápidas e tempos de exposição curto). No entanto, as câmeras monocromáticas só pode capturar um único canal de emissão (a detecção de um único fluoróforo) para coletar imagens. Sistemas de divisão de emissão de uma única câmara podem ser incorporados para captar vários canais de emissão, mas muitas vezes reduzir o campo de visão e exigem o mesmo tempo de exposição para a imagem de todos os canais. Para capturar o espectro de cores a partir de células marcadas com multiple fluoróforos, uma câmara de cor pode ser usado como alternativa. No entanto, câmeras de cor geralmente não são capazes de fornecer a resolução temporal desejado para imagens de células vivas em determinadas aplicações. Outro dispositivo de imagem é necessária para aplicações em que é vantajosa a imagem de células vivas em vários comprimentos de onda, mantendo uma alta resolução temporal. Uma aplicação experimental principal é o ensaio de adesão de câmara de fluxo de placas paralelas, em que as células são perfundidos em condições fisiologicamente relevantes sobre um substrato potencialmente reactiva 1, 3. As células em fluxo que expressam moléculas da superfície celular específicos podem aderir e rolo sobre o substrato, tal como uma monocamada de células que expressam as moléculas de adesão ou de proteínas extracelulares adsorvido à superfície da matriz 4, 5. Rolando células podem sofrer movimento de rotação e de translação em frações de segundo. Características moleculares sobre rolamento e células aderentes, tais como aglomerados de moléculas de superfície celular, também têm o potenciômetroal de sofrer reorganização activa na superfície da célula. Assim, sistemas de imagem deve fornecer uma resolução temporal excepcional (30 quadros por segundo ou mais, e &quot;quase zero&quot; tempos de exposição) para gerar uma seqüência de imagens que ilustra a progressão passo-a-passo de célula rolando 6, 7. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla são capazes de atender a essas demandas para a imagem latente células marcadas com vários fluoróforos. Sistemas de divisão de emissão câmera dupla dividir e canais de fluorescência do filtro em duas câmeras semelhantes de capturar simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicos de fluoróforo, mantendo o pleno campo de visão. Esta tecnologia permite a comparação direta da imagem capturada em tempo real em cada canal e permite ao usuário alternar rapidamente entre os modelos de câmeras com diferentes capacidades de imagem. Esse recurso é útil para fazer ajustes nas configurações de captura de imagem em uma câmera que melhor permitem que o sistema para capturarfluoróforos com diferentes intensidades, vidas, e coeficientes de extinção 8. Juntamente com o software de imagem, sistemas de divisão de emissão da câmera dupla permite a gravação em tempo real de ensaios de imagens de células vivas em vários comprimentos de onda e pode aumentar a ensaios in vitro que utilizam a fluorescência para estudar o comportamento das células.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

A microscopia de imunofluorescência multi-color para detectar moléculas específicas na membrana da célula pode ser acoplado com os ensaios de câmara de fluxo paralelo à placa de investigar os mecanismos que regulam a adesão de células em condições de escoamento dinâmico. Por exemplo, as células cancerosas marcadas com vários fluoróforos podem ser perfundidos sobre um substrato potencialmente reativo para modelar mecanismos de metástase do câncer. No entanto, multi-canal de sistemas únicos de câmera e câmeras coloridas deficiências apresentam na aquisição de imagens para análise de células vivas em tempo real. Para superar essas limitações, foi utilizado um sistema de separação de emissão de câmara dupla de capturar simultaneamente sequências de imagens em tempo real de células marcadas com fluorescência na câmara de fluxo. Comprimento de onda do filtro sistemas de divisão de emissão dupla de câmera definido varia em duas câmeras CCD monocromático, capturando, assim, simultaneamente duas imagens idênticas, mas espacialmente específicas do fluoróforo. Subsequentemente, psuedocolored imagens de um canal são combinados numa únicaem tempo real fundiu seqüência que pode revelar várias moléculas-alvo em células movendo-se rapidamente através de uma região de interesse.

Um ensaio de adesão câmara de fluxo de placas paralelas foi utilizado para demonstrar um sistema de separação de emissão de câmara dupla que simultaneamente capturado sequências de imagens em tempo real em dois canais de emissão (Figura 1). O sistema de separação de emissão de câmara dupla detectado células BT-20, que foram marcadas por fluorescência com CD24 anti-humano e HECA-452 (detecção de antigénios sialofucosylated) anticorpos monoclonais e anticorpos secundários adequados <stro...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos.

Simultaneamente Capturar imagens em tempo real em dois canais de emissão Usando um sistema de separação, Dual Camera Emissão: Aplicações de Adesão Celular

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K visualizações.  Ohio University.  Sistemas de divisão de emissão dupla de câmera para microscopia de fluorescência de duas cores gerar seqüências de imagens em tempo real com resolução óptica e temporal excepcional, uma exigência de determinados ensaios de células ao vivo, incluindo ensaios de adesão câmara de fluxo de placas paralelas. Quando o software é utilizado para fundir imagens de canais de emissão adquiridas simultaneamente, seqüências de imagens pseudocolored são produzidos. 

Vídeo: Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Estudo da migração celular em Canais microfabricados

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Usando impedância Cell-substrato e imagens de células vivas para medir as mudanças em tempo real no celular Adesão e De-adesão Induzidas por Matrix Modificação

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoramento em Tempo Real de intracelular Bile Ácido Dynamics usando um sensor Ácido Bile baseado em FRET codificados geneticamente

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Hand-Held fotoacústico clínico sistema de imagem para imagens de animais em tempo real não-invasiva pequenas

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

Em Situ Microscopia para determinação em tempo real da morfologia unicelular em bioprocessos

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Fabricação de um Nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH de Monitor em tempo real durante a fermentação microbiana

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...