Células endoteliais glomerulares imortalizadas com mitocôndrias fluorescentes estáveis são uma ótima ferramenta para examinar o efeito de diferentes estímulos na estrutura mitocondrial in vitro. O método descrito no presente artigo produz um elevado número de células endoteliais glomerulares. Ao testar pequenas moléculas em um GEC, poderíamos rastrear a monoterapia para a doença renal diabética, onde os GECs são afetados.
O método descrito é fácil de executar e não requer equipamento específico. No entanto, é importante seguir os passos descritos e esterilizar o equipamento para evitar a contaminação. Para começar, coloque os materiais de perfusão e isolamento necessários para isolar as células glomerulares renais em um espaço de trabalho.
Filtre a solução salina balanceada de Hanks, ou HBSS, recém-preparada, com um filtro de 0,2 mícron e mantenha-a sob o capô para evitar a contaminação. Em seguida, misture 200 microlitros de contas magnéticas com 20 mililitros de HBSS. Pré-aqueça o PMR com 10%FCS e meio de cultura de células endoteliais em banho-maria a 37 graus Celsius.
Em seguida, pré-cubra dois poços de uma placa de seis poços com dois mililitros de 10 microgramas por mililitro de colágeno IV por 45 minutos à temperatura ambiente. Lave a placa duas vezes com PBS para remover o ácido acético usado para diluir o colágeno. Use as placas revestidas imediatamente ou armazene-as a dois a oito graus Celsius por até quatro semanas.
Limpe os instrumentos cirúrgicos e o espaço de trabalho com etanol a 70%. Posteriormente, autoclave os instrumentos cirúrgicos por 30 minutos. Depois de abrir o abdômen de um rato anestesiado, insira uma agulha de borboleta no ventrículo esquerdo.
Para injetar 100 microlitros da solução de grânulos para expandir a circulação sanguínea, quebre cuidadosamente a veia cava inferior abaixo dos rins com uma agulha de calibre 19 e continue a perfusão da solução de contas. Em seguida, remova suavemente o tecido adiposo com pinças, excise ambos os rins com uma tesoura cirúrgica fina C e coloque-os em um prato com um mililitro de HBSS no gelo. Pique o rim com um bisturi estéril em pedaços pequenos de um milímetro.
Incubar o rim picado com um milímetro de colagenase tipo II recém-preparada por 35 minutos a 37 graus Celsius com inclinação suave em um agitador horizontal. Após a digestão, adicione quatro mililitros de RPMI com 10% FBS para neutralizar a colagenase. Filtre o tecido digerido através de um filtro de células estéreis de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros.
Use o fundo de um tubo estéril de 1,5 mililitro para mexer o tecido digerido contra o coador, permitindo que os glomérulos passem. Lave o filtro celular com 15 mililitros de HBSS. Em seguida, centrifugar o fluxo a 200 XG por cinco minutos à temperatura ambiente.
Nesta fase, o tubo contém três camadas. A camada superior contém estruturas menores, como túbulos, a camada intermediária é de contas com glomérulos e a camada inferior contém detritos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e a camada branca superior.
Em seguida, ressuspenda o pellet contendo contas com os glomérulos e detritos em 1,5 mililitros de HBSS e transfira-o para um tubo de dois mililitros. Coloque o tubo em um concentrador magnético e aspirar o sobrenadante antes de lavar as contas duas vezes com um mililitro de HBSS. Coloque 20 microlitros de suspensão celular em um slide.
Em seguida, observe a lâmina sob um microscópio para a presença de glomérulos. Em seguida, ressuscite o pellet em um meio de crescimento de células endoteliais e transfira a suspensão para um tubo de dois mililitros. Adicione um microlitro de interferon gama para cada três mililitros de meio e coloque as células em uma placa de seis poços para incubação a 33 graus Celsius.
Após três dias de cultura, substitua cuidadosamente o meio de um mililitro por um meio fresco. Nesta fase, as células são heterogêneas com uma mistura de células glomerulares. Após sete dias, substitua o meio por dois mililitros de meio de crescimento de células endoteliais frescas, suplementado com interferon gama para iniciar a proliferação celular.
Após 10 dias, quando as células atingirem 80% de confluência, passá-las usando tripsina e transferi-las para um frasco de T-25 revestido com colágeno IV.Após 21 dias de cultura, transfira as células para um frasco de T-75. Adicionar três mililitros de tripsina a 0,25% a um frasco de T-75 e incubar as células a 37 graus Celsius durante cinco minutos. Em seguida, neutralize a tripsina com três mililitros de meio de crescimento endotelial e transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros para centrifugação a 200 XG por cinco minutos.
Aspirar o sobrenadante e lavar as células em um mililitro de PBS contendo 1% de BSA, EDTA de dois milimolares, 1% de penicilina/estreptomicina. Novamente, centrifugar e ressuspender o pellet em 200 microlitros de contas revestidas com anticorpos CD31 e 800 microlitros de PBS. Incubar as células durante 45 minutos com agitação contínua a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, coloque o tubo no concentrador magnético e lave as células quatro vezes com PBS contendo BSA, EDTA e penicilina/estreptomicina. Após a última lavagem, ressuspender as células em três mililitros de meio de crescimento endotelial, suplementado com interferon gama. Placa de 1,5 mililitros de células por poço em poços revestidos de colágeno IV em uma placa de seis poços e cultura sob condições permissivas a 33 graus Celsius.
Após quatro dias, substitua 750 microlitros do meio por um meio de crescimento endotelial fresco, suplementado com interferon gama. Após 10 a 14 dias de cultura, usando um microscópio de epifluorescência com um filtro de 488 nanômetros, observe o crescimento de células endoteliais glomerulares positivas para CD31, ou GECs, colônias que expressam mitocôndrias fluorescentes. Após 21 dias, ou quando as células tiverem atingido 80 a 90% de confluência, transferi-las para um frasco de T-25.
Manter a cultura com um meio de crescimento RPMI contendo 10%FCS. Alternativamente, as células podem ser criopreservadas. Células de passagem usando tripsina, como demonstrado anteriormente.
Em seguida, centrifugar as células e ressuspender o pellet em três mililitros de meio de congelamento. Aliquotar as células em tubos criogênicos e armazená-las em nitrogênio líquido, temperatura de vapor. Este protocolo descreveu um método para o isolamento de células endoteliais glomerulares.
A partir dos glomérulos isolados, as células começaram a crescer lentamente após três dias de cultura. Após sete dias, as células apareceram heterogêneas e apresentaram outros tipos de células glomerulares, como podócitos, células parietais, epiteliais e mesangiais. Após atingir 70 a 80% de confluência, outras células glomerulares foram removidas usando uma seleção positiva de células endoteliais.
Os GECs de MitoDendra2 expressaram CD31 e foram negativos para o marcador de podócitos, como demonstrado pela coloração negativa de sinaptopódios. O efeito da concentração de glicose na estrutura mitocondrial foi examinado. Em comparação com as mitocôndrias alongadas visíveis em células sob glicose normal, a glicose elevada induziu fragmentação ou fissão das mitocôndrias, como observado por mitocôndrias proeminentes em forma de esferoide.
Além disso, um laser de 405 nanômetros foi usado para fotoconverter uma subpopulação selecionada de mitocôndrias em um único MitoDendra2 GEC vivo. Uma fotocomutação bem-sucedida de mitocôndrias de verde para vermelho na área selecionada para células tratadas com concentração normal e alta de glicose é mostrada. Esta comutação permitiu testemunhar os eventos de fusão em GECs MitoDendra2.
Sob glicose normal, a fluorescência verde e vermelha amarela mesclada foi observada devido à fusão da matriz mitocondrial. Em contraste, nos GECs tratados com alta glicose, as mitocôndrias estavam principalmente fragmentadas. Colocar as células em um poço de placa de seis poços com um pequeno volume de meio de crescimento é essencial para deixar as células se ligarem ao prato.
As células endoteliais isoladas poderiam ser usadas para realizar a função mitocondrial e estudos estruturais. O uso de células endoteliais imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes abrirá o caminho para a descoberta de medicamentos. As pequenas moléculas podem ser testadas nas células, e imagens ao vivo são realizadas para examinar seu efeito na função das mitocôndrias.
