Este protocolo descreve um método para rastrear rapidamente milhares de genomas usando espermatozoides de peixe-zebra injetados com F0 CRISPR. Esta técnica é vantajosa em sua acessibilidade. Em vez de abordagens caras e especializadas baseadas em sequenciamento, nosso método usa enzimas de restrição de PCR e eletroforese em gel para rastrear portadores machos F0 em busca de indels ou edições específicas do genoma.
A parte mais difícil desse procedimento é apenas obter os espermatozoides rapidamente, mas se torna uma boa técnica para fertilização in vitro se trabalharmos com muitos peixes dismórficos, e por isso é uma maneira fácil de cruzarmos peixes que estão nos dando problemas. Comece montando tanques de reprodução para peixes do tipo selvagem e F0 e incube os tanques durante a noite. Depois de anestesiar o peixe macho no dia seguinte, use uma colher de fenda para transferi-lo para uma pilha de toalhas de papel limpas.
Enrole suavemente o peixe para remover o excesso de água. Retire qualquer água, borrifando-a seca com um tecido dobrado limpo. Usando a colher de fenda, transfira o peixe para a esponja preparada.
Coloque o lado ventral do peixe para cima e limpe suavemente a área ao redor das nadadeiras anais com um papel de seda limpo dobrado. Para coletar os espermatozoides, use um tubo capilar para mover suavemente as nadadeiras pélvicas para longe da linha média, expondo a cloaca. Coloque o tubo capilar próximo à cloaca.
Com os dedos ou um par de pinças de filtro, aperte suavemente as laterais do peixe das brânquias para baixo. Usando ação capilar, colete os espermatozoides no tubo e coloque-o em um tubo de PCR contendo 40 microlitros de solução de hidróxido de sódio 50 milimolares e, em seguida, expulse a amostra para o tubo. Depois de girar as amostras de esperma em uma mini centrífuga, coloque os tubos de PCR em um termociclador.
Execute o ciclador aquecendo as amostras por 40 minutos a 95 graus Celsius, seguido de resfriamento a 25 graus Celsius. Após a retirada das amostras do ciclador, neutralizar o pH adicionando 10 microlitros de cloridrato de tris molar de pH oito. Misturar aspirando a suspensão e, em seguida, centrifugar as amostras.
Ajuste o termociclador a 95 graus Celsius para pré-aquecimento. E, enquanto isso, prepare 25 microlitros da mistura de reação de PCR para cada amostra de esperma. Misture bem pipetando para cima e para baixo e, em seguida, gire as amostras.
Coloque as amostras no termociclador pré-aquecido e ajuste o ciclo. Para obter uma solução de gel, leve ao micro-ondas uma solução de gel de agarose a 4% preparada misturando pó de agarose, coloração de gel e tampão TBE. Despeje a solução de gel em uma estrutura de fundição de gel e insira um pente de um lado.
Após a solidificação do gel, remova cuidadosamente o pente. Coloque o gel em uma plataforma de eletroforese de modo que os poços estejam mais próximos do eletrodo negativo. Despeje o tampão de corrida TBE na plataforma até que os poços estejam totalmente submersos.
Comece a carregar o gel pipetando cinco microlitros de escada de DNA no primeiro poço. Carregue os poços restantes com 5 a 10 microlitros do produto da PCR. Passe o gel por 1 hora a 150 volts para garantir a separação adequada dos amplicons.
Use o imageador de gel para visualizar as bandas de DNA. A análise do locus p2RY12 mostrou que o amplicon do tipo selvagem exibia uma única banda de 250 pares de base de comprimento, enquanto os amplificadores machos injetados em F0 contendo indels funcionavam como bandas múltiplas. A análise do locus DNAh10 mostrou que o Amplicon selvagem funciona como uma única banda longa de 400 pares de bases.
Os amplicons machos injetados em F0 contendo indels funcionaram como bandas múltiplas ou como uma única banda com mobilidade de gel diminuída. O macho número um injetado com F0 tinha uma banda adicional no produto digerido, que estava ausente no produto de PCR, tornando-o o melhor candidato fundador para o estabelecimento de linha de knock-in mutante. Se um peixe macho não produz esperma quando espremido, é melhor descansar o peixe por uma semana e tentar novamente em vez de apertá-los com muita força e correr o risco de machucá-los.
Uma vez que o FC ou o fundador do sexo masculino é cruzado, os alelos precisam ser verificados na progênie F1. Sequenciar os amplicons F1 diretamente e realizar análise de alelos heterozigotos é uma maneira fácil de fazer isso.
