O objetivo geral deste método é analisar o efeito do tratamento do estresse em células bacterianas, tanto na célula única quanto no nível populacional. Ele fornece uma visão global do efeito do estresse em vários aspectos do crescimento bacteriano, incluindo viabilidade celular, morfologia e conteúdo de DNA. Também permite caracterizar a recuperação populacional.
Este método poderia ser usado na indústria farmacêutica para testar a atividade de novas moléculas antimicrobianas e apreciar seu impacto na viabilidade e crescimento das bactérias. O tratamento indutor de estresse tem uma ineficiência, como dose e tempo dependente. Pode ser necessário realizar testes preliminares para determinar a dose ideal e a duração do tratamento antes de iniciar este protocolo.
A demonstração visual deste método permite imaginar detalhes importantes de cada etapa crítica e como executá-las corretamente. Para começar, inocular cinco mililitros de MOPS EZ Rich Defined Medium com uma única colônia de E.Coli MG1655 HU-PAmCherry e crescer a 37 graus Celsius com agitação a 140 rotações por minuto durante a noite. Na manhã seguinte, extraia 100 microlitadores da amostra e dilui-a com 900 microliters de meio para medir a densidade óptica em 600 nanômetros.
Em seguida, diluir a cultura em um tubo de ensaio contendo meio fresco para um nanômetro OD600 de 0,01. Incubar o tubo de ensaio inoculado a 37 graus Celsius com agitação a 140 RPM até que a densidade óptica atinja 0,2, correspondendo à fase exponencial completa em meio rico. Em seguida, aliquotar as amostras de cultura para imagens de microscopia de lapso de tempo, o ensaio de diluição e revestimento, a análise de citometria de fluxo e a imagem de snapshot de microscopia.
Exponha os 4,4 mililitros restantes da cultura celular no tubo de ensaio ao tratamento específico do estresse. Por exemplo, 4,4 microliters de cefaleia a cinco microgramas por mililitro e incubam a 37 graus Celsius com agitação a 140 RPM. Prepare diluições seriais dez vezes, até 10 a menos a sétima, dos 200 microliters da amostra de cultura em meio fresco.
Misture cada diluição por vórtice muito suave ou invertendo o tubo. Placa 100 microliters da diluição apropriada em placas de agarose LB não selecionadas e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, conte o número de colônias para determinar a concentração de células viáveis em cada amostra de cultura.
Plote a UFC por mililitro em função do tempo para as culturas celulares não tratadas e tratadas. Meça o OD600 da cultura em um espectrofotômetro. Diluir a amostra de cultura com meio fresco a quatro graus Celsius para obter uma amostra com OD600 a 0,06, correspondendo a aproximadamente 15.000 células por microliter.
Para coloração de DNA, misture a amostra bacteriana diluída com uma solução de 10 microgramas por mililitro de corante fluorescente de DNA na ração de volume de um a um e incubar no escuro por 15 minutos. Antes da injeção da amostra, misture a amostra por vórtice muito suave ou invertendo o tubo. Passe a amostra para o citômetro de fluxo a uma taxa de fluxo de aproximadamente 120.000 células por minuto.
Adquira luz dispersa para a frente e dispersa lateral, bem como corante fluorescente de DNA/sinal fluorescente com as configurações apropriadas. Plote o histograma de densidade celular dispersa para representar a distribuição do tamanho da célula e traçar o histograma de densidade celular fluorescente/sinal fluorescente de DNA para representar o conteúdo do DNA na população celular. Primeiro, pré-aqueça a câmara de microscópio termostato a 37 graus Celsius para estabilizar a temperatura.
Prepare os slides montados em agarose, como descrito no manuscrito. Coloque o slide no estágio do microscópio e realize a aquisição de imagens usando luz transmitida com um objetivo de contraste facial e com excitação de fonte de luz em 560 nanômetros para mCherry. Selecione campos de visão que contenham células isoladas para facilitar a detecção automatizada de células durante a análise de imagens.
Certifique-se de que pelo menos 300 células sejam imagens para permitir uma análise estatística robusta da população celular. Primeiro, remova a solução de conservação da placa microfluidica e substitua-a por um meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius, conforme descrito no Guia do Usuário de Software Microfluidic. Conecte a placa microfluidica ao sistema coletor.
E no software microfluido, clique no botão Selar para selar a placa ao sistema coletor. Depois disso, clique no botão Priming. Posicione a placa microfluida com o sistema de coletores no estágio do microscópio e pré-aqueça a 37 graus Celsius por duas horas para evitar a dilatação da câmara microfluidica.
Sele a placa microfluida no sistema microfluido clicando no botão Seal Off. Substitua o meio de oito poços por 150 microliters de amostra de cultura e substitua o meio de um a cinco poços pelo meio desejado, com ou sem o reagente indutor de estresse. Sele a placa microfluidica e coloque-a no estágio do microscópio.
No software microfluido, execute o procedimento de carregamento de células. Verifique se o carregamento das células é satisfatório olhando sob o microscópio em luz transmitida. Concentre-se cuidadosamente no modo de luz transmitida e selecione vários campos de visão que mostram bactérias isoladas e não estão superlotados, em torno de 10 a 20 células por 100 microliters quadrados.
No software microfluido, clique no botão Executar uma sequência personalizada e programe a injeção do meio indutor de estresse durante 10 minutos em dois PSI, seguido de injeção em um PSI durante a duração desejada do tratamento de estresse. Realize imagens de microscopia no modo lapso de tempo com um quadro a cada 10 minutos, usando contraste de fase em luz transmitida e uma fonte de luz de excitação de 560 nanômetros para o sinal mCherry, se necessário. Inicie a aquisição de imagens microscópicas e o protocolo de injeção microfluidic ao mesmo tempo.
Abra o software Fiji e o plugin MicrobeJ. Para análise de instantâneos, solte todas as imagens correspondentes a um slide de microscópio na barra de carregamento do MicbeJ para concatenar imagens e salvar o arquivo de pilhas de imagens obtidas. Para dados de lapso de tempo, basta soltar a pilha de imagens na barra de carregamento do MicrobeJ.
Execute a detecção automatizada dos contornos da célula com base na segmentação da imagem de contraste de fase e execute a detecção dos nucleóides com base na segmentação do sinal fluorescente de DNA manchado. Verifique a precisão da detecção da célula visualmente e use a ferramenta de edição do MicrobeJ para correção, se necessário. Salve o arquivo de resultado obtido.
Clique no ícone ResultJ para concluir a análise e obter a janela ResultJ. Muitos tipos diferentes de gráficos de saída são gerados. Plote os histogramas normalizados de forma ou comprimento celular e número nucleóide médio por célula.
Este estudo analisou o comportamento das células Escherichia coli K-12 durante a exposição transitória à cefalonica, um antibiótico que inibe especificamente a divisão celular. Culturas celulares crescendo na presença de cefaloxiina apresentaram aumentos semelhantes de OD600 como as culturas não-apoiadas. A concentração de células viáveis não aumentou quando a cefaloxilite estava presente.
As células começaram a se dividir novamente quando a cefaloxiina foi removida e eventualmente atingiu uma concentração equivalente à cultura não-costureira após duas horas. Diferentes tensões resultaram em diferentes desacoplamentos do OD e CFU por curvas mililitros, dependendo do efeito induzido. A exposição à cefaleia provocou um aumento paralelo do tamanho celular e do conteúdo de DNA.
Quando a cefaloxina foi removida, o tamanho da célula populacional e o conteúdo de DNA gradualmente diminuíram e se tornaram semelhantes à população não-costureira após duas horas. A cefaleia provocou a formação de células longas com largura celular normal e, em seguida, sem septa de divisão. A análise quantitativa da imagem confirmou o aumento do tamanho da célula e do conteúdo do DNA.
Imagens de lapso de tempo confirmam que o alongamento celular e a replicação e a segregação do cromossomo não foram inibidos pela exposição à cefaloxina. A análise da linhagem celular filamentada mostrou que a divisão celular recomeçou cerca de 20 minutos depois de lavar a droga. É crucial garantir que a população bacteriana esteja em pleno crescimento exponencial antes de induzir tratamentos de estresse.
O tratamento indutor de estresse usado para essas abordagens pode ser perigoso para o experimental, como o composto genotóxico. Então manuseie o composto com cuidado e use luva, máscara, óculos e jaleco.
