O protocolo facilita o funcionamento da cultura dos organoides cerebrais e ajuda a promover a aplicação de organoides cerebrais. O organoide do estágio anterior pode ser visto a olho nu usando uma lâmpada de luz macia lateral que é conveniente para muitas operações. Os métodos aprimorados de mudança média e as operações de transferência de organoides também são úteis para outros tipos de culturas organoides e para o desenho de máquinas de culturas automáticas.
Para começar, cultura os iPSCs com mTeSR1 médio em um matrigel coberto 35 milímetros placa petri e mudar o meio todos os dias. A densidade de crescimento do iPSC não deve exceder 75% Em seguida, pipeta fora do mTeSR1 médio dos iPSCs e lavá-lo duas vezes com um milímetro de PBS. Após a pipetação do PBS, adicione 300 microliters da solução de descolamento celular para digerir os iPSCs em células únicas por três a quatro minutos a 37 graus Celsius.
Posteriormente, resuspenge as células em dois milímetros de média de formação de EB e centrifugar a amostra por cinco minutos a 300 vezes g. Trate a placa especializada de 24 poços com 500 microliters por poço de solução anti-adesão por cinco minutos. Agora, resuspensar as células no meio de formação EB contendo inibidor de Rho quinase Y27632.
Depois de remover a solução anti-adesão, enxágue cada poço com dois mililitros de meio de formação EB. Em seguida, adicione as células às 24 placas de poço especializadas a uma densidade de três vezes 10 às sextas células por poço e centrifugar a placa a 100 vezes g por dois minutos à temperatura ambiente. Distribua uniformemente as células em cada câmara na parte inferior da placa.
Incubar as amostras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Se a centrifugação não foi utilizada na etapa anterior, incubar por 36 horas e manter a amostra estável. Use uma placa acrílica transparente com uma espessura de 0,3 a 0,5 centímetros no tamanho de papel A5 e cole almofadas brancas na frente e atrás da placa acrílica.
Em seguida, instale uma fileira de luzes brancas led na borda da placa para que as luzes possam entrar pelo lado da placa acrílica e, em seguida, disparar em paralelo. Agora, prepare uma nova placa de seis bem baixa adesão e adicione dois mililitros de meio de formação EB para cada poço. Depois de remover os EBs juntamente com o meio usando 1000 microliters de largura ponta de pipeta, transfira aproximadamente 100 EBs por poço para a placa de seis bem baixa adesão.
Para substituir o meio de formação EB todos os dias com o mesmo volume de meio fresco, induza um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado através da rotação. Aspire o meio antigo ao esncanar até a borda do poço lentamente.
Não chupe muito forte, caso contrário os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione mídia fresca para resuspensar os EBs. Para indução neural, prepare uma nova placa de seis bem baixa adesão com três mililitros de meio de indução neural por poço.
Ligue a luz suave lateral e desligue outras fontes de luz interior. Agora transfira os EBs para a placa de seis poços com meio de indução neural adicionado usando uma ponta de pipeta de boca larga para sugar tanto os EBs quanto o meio de cultura. Em seguida, segure a pipeta ereto.
Os EBs gradualmente afundarão sob gravidade e convergirão em direção à boca da ponta da pipeta. À medida que a boca da ponta da pipeta toca novamente a superfície líquida, e devido à tensão da superfície líquida, os EBs rapidamente afundam no meio. Incubar as amostras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Coloque a matriz de membrana em uma geladeira de quatro graus Celsius por 60 minutos para dissolver. Depois de ligar a luz suave lateral, desligue a fonte de luz na parte superior do console e mantenha a matriz de membrana no gelo para evitar a solidificação. Transfira uma pequena quantidade de EBs para um prato de 60 milímetros contendo um meio de expansão fresco para facilitar a remoção de um EB único. Usando uma ponta de pipeta de 200 microliters de largura, chupe um único EB contendo aproximadamente 10 microliters médios cada vez, e, em seguida, faça gotículas adicionando-a ao fundo da placa de seis poços.
Use cinco gotículas por poço. Adicione 15 microliters da matriz de membrana a cada EB contendo gota. Misture e incorpore rapidamente a bola EB no centro da gota.
Deixe que as gotículas que contêm EBs se solidifiquem colocando a placa de seis poços em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione três mililitros do meio de expansão a cada poço e exploda suavemente os EBs incorporados da matriz para suspendê-los e incubar por três dias. Para maturação organoide, remova suavemente o meio original e adicione três mililitros de meio de maturação a cada poço.
Coloque a placa organoide em um agitador horizontal em uma incubadora de 37 graus Celsius e continue a girar a cultura horizontalmente. Mude o meio de maturação fresco a cada dois ou três dias. Devido à gravidade e densidade relativamente maior do que o médio, os EBs resuspended afundarão gradualmente.
Assim, os EBs podem ser convenientemente transferidos. Em comparação com os EBs, células livres e fragmentos de células mortas afundam mais lentamente. A maioria das células livres e fragmentos de células mortas podem, assim, ser removidos.
Os EBs cultivados na fase inicial expressaram o marcador OCT4 que indicava boa pluripotência. No estágio posterior, os EBs desenvolveram-se em organoides cerebrais maduros. Os organoides cerebrais maduros foram positivos para as células progenitoras apical marcador PAX6 e neurônio específico tubulin marcador J1. Os iPSCs de indivíduos saudáveis e pacientes SCA3 foram cultivados para crescer em organoides.
Os perfis de expressão genética do grupo organoide cerebral normal e do grupo organoide cerebral SCA3 apresentaram diferenças significativas em vias como transporte neurotransmissor, formação de sinapse e regulação. Ao incorporar o EB com matriz de membrana de porão, os tempos de operação não devem ser muito longos para evitar a secagem dos EBs. Recomenda-se proteger rapidamente.
