Este método pode ser usado para avaliar os efeitos da imunidade pré-existente contra o vírus da dengue na infecção pelo vírus Zika, usando soro humano real e células imunes humanas primárias. O uso de amostras reais de soro de pacientes humanos e células primárias humanas fornecem uma visão mais profunda do aprimoramento dependente de anticorpos do vírus Zika por soro pré-imune e anticorpos. Este método fornece uma visão da capacidade dos anticorpos dentro do sangue de um paciente para melhorar uma infecção por vírus em outras células humanas.
É importante garantir que os níveis de infecção viral sejam altos o suficiente para detecção, mas baixos o suficiente para não sobrecarregar as células ou interferir na interpretação dos dados. Comece semeando três vezes dez para as quatro células em 100 microliters de cultura celular média por poço em uma placa estéril, fundo plano 96-bem. Quando todas as células tiverem sido banhadas, coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 37 graus Celsius e 5% e faça diluições 10 vezes mais séries de amostras de soro humano descongeladas em meio livre de soro.
Certifique-se de manter as diluições do soro e o fator de diluição constantes para todos os soros pré-imunes antes de adicionar as diluições às soluções do vírus e às células. Em seguida, descongele a solução de estoque do vírus Zika em um banho de água de 37 graus Celsius por um a dois minutos antes de transferir rapidamente o estoque para o gelo. Adicione uma multiplicidade de 0,1 de infecção equivalente ao volume do vírus Zika às alíquotas do soro e coloque a placa na incubadora de cultura celular por uma hora para permitir que os anticorpos do vírus da dengue formem complexos com os virions do Zika.
No final da incubação, lave as células com 100 microlitres de PBS por poço e adicione 50 microliters de complexo imunológico a cada poço. Após a incubação de duas horas, remova o meio e lave os poços duas vezes com 100 microliters de PBS por poço para remover completamente os complexos imunológicos e quaisquer virions não ligados. Em seguida, alimente as células com 100 microliters por poço de cultura celular complementada com soro bovino 10%.
Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por 48 horas. Dois dias após a infecção, lave as células duas vezes com 100 microliters de PBS estéril por poço antes de adicionar 250 microliters de tampão de lise celular com 10% de mercaptoetanol beta para cada poço. Pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco vezes com arranhões para acelerar o processo de lise e transferir os lises celulares para tubos estéreis rotulados de 1,5 mililitro.
Adicione um volume igual de 70% de etanol a cada tubo e pipeta a solução de lise para cima e para baixo quatro a cinco vezes. Quando as suspensões de lise estiverem claras, transfira cada solução para colunas rotuladas à base de sílica em dois tubos de coleta de mililitros para centrifugação. Descarte o fluxo mantendo as colunas nos mesmos tubos de coleta e adicione 700 microliters de Wash Buffer 1 a cada coluna para uma segunda centrifugação.
Depois de descartar o fluxo, enxágue as colunas mais duas vezes com 500 microliters de Wash Buffer dois por lavagem. Após a segunda lavagem, transfira as colunas para novos dois tubos de coleta de mililitros para outra centrifugação. Adicione 30 microliters de 42 graus Celsius RNase-Free água ao centro de cada coluna para centrifugação e recupere o RNA elucido.
Para a reação quantitativa em cadeia de polimerase em tempo real ou análise de QRTPCR adicione um microliter de primers específicos de genes para a frente e para trás de 10 estoques de micromolar, juntamente com 0,25 microlitros de mix de transcriptase reversa por reação. Observe que os primers que reconhecem o material genético do vírus Zika detectarão genes virais e permitirão quantificação de infecções. Em seguida, adicione 12,5 microliters de SYBR Green Mix seguido por 25 microliters de água a cada reação adicionando 15 microliters de Master Mix em cada poço de placa QPCR de 96 poços.
Ao usar uma Mistura Master, adicione 100 nanogramas da amostra de RNA à mistura e pipeta do Mix Master em poços individuais da placa QRTPCR. Observe que as amostras devem ser executadas em triplicado na mesma placa QRTPCR. Em seguida, execute as amostras em uma máquina de PCR quantitativa de acordo com os parâmetros descritos na tabela.
Clicando na guia curva de derretimento no software do sistema para monitorar a curva de derretimento. A curva de derretimento mostrará um único pico em todas as amostras para um gene específico para confirmar a presença de apenas um amplicon. Para obter ótimos resultados, use incrementos de temperatura de 0,5 graus Celsius entre as etapas e um tempo mínimo de retenção de 10 segundos no protocolo da curva de derretimento.
Em seguida, clique na guia de dados de quantificação para obter um ciclo quantitativo para cada amostra e exporte os dados para uma planilha para análise de quantificação posterior. As amostras de soro humano podem ser categorizadas em três grupos diferentes: amostras confirmadas de infecção pelo vírus da dengue, anticorpo confirmado pelo vírus da dengue e soro saudável sem vírus da dengue neutralizando anticorpos ou RNA. Após 48 horas de infecção, a análise do QRTPCR demonstra que a maioria dos sorotipos do vírus da dengue de um a quatro anticorpos são capazes de melhorar a replicação do vírus Zika em diferentes níveis.
O maior aumento das mamas do zika vírus é encontrado em macrófagos tratados com sorotipo de vírus da dengue contendo sorotipo 2 e 4 anticorpos em comparação com o sorotipo um e três que mostram uma indução relativamente menor do vírus Zika. É importante manter um ambiente estéril, usar os equipamentos de proteção pessoal adequados e manter sempre as amostras de soro de vírus descongelados e reagentes QPCR no gelo. Este protocolo pode ser facilmente modificado para estudar o aprimoramento dependente de anticorpos de outros flavivírus, como vírus da febre amarela, vírus da dengue ou vírus do Nilo Ocidental usando um painel de soro do paciente.
Esta técnica será altamente útil para a realização de futuros estudos de aprimoramento dependentes de anticorpos nos campos de arbovírus ou virologia. O equipamento de proteção pessoal adequado nível dois deve ser usado o tempo todo e todos os resíduos virais devem ser descontaminados em alvejante de 10% durante 30 minutos antes do descarte.
