Bu çalışma, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu-SINGING PLANT Projesi (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Bu proje, Avrupa Birliği tarafından finanse edilen MSCA4Ukraine projesi (ID 1233580) aracılığıyla fon almıştır. Şekil 1'in grafik tasarımı için Lenka Sochurkova'ya minnettarız.

1. Orta hazırlık
<ol><li>Bir Petri plakası (120 x 120 x 17 mm) için% 1.5 (a / h) konsantrasyon elde etmek için 0.75 g jelleştirici maddeyi 50 mL steril deiyonize su ile bir cam şişede karıştırarak yetiştirme ortamını hazırlayın. Karışımı hafifçe çalkalayın ve ardından jelleştirici maddeyi çözmek için kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtın (çözelti berraklaşır).</li>
	<li>Sonraki adımlara geçmeden önce ortamın 58-60 °C'ye soğumasını bekleyin. Sonraki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı bir başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Ölçümler sırasında aşırı aktinik ışık yansımasını ve yüksek arka plan otofloresansını önlemek için ışık geçirmez kenarlı Petri plakaları kullanın. Bunun için, boş Petri plakasının tüm kenarlarını kaplayacak şekilde siyah yapışkan bant (veya mevcut diğer araçlar) uygulayın (Şekil 2).</li>
	<li>Bant uygulamasından sonra 20-30 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası ile ışınlanarak plaka(lar)ın sterilizasyonunu gerçekleştirin.</li>
	<li>Deney kimyasal işlem içeriyorsa (yani, abiyotik/biyotik stres faktörleri, bitki hormonları ve/veya büyüme düzenleyiciler, vb.), uygun miktarda karşılık gelen kimyasalı doğrudan ortama ekleyin. Ortama eklenen seçilmiş bir kimyasal stabilitenin farkında olun (örneğin, kimyasal termostabil değilse, plakaya dökmeden hemen önce soğuduğunda ortama ekleyin). Kimyasalın eşit dağılımını sağlamak için ortamı çalkalayarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Ortam döküldükten sonra plakaların UV ışığına aydınlatılmasından kaçının (deneye müdahale edebilecek oksijen radikali üretimine yol açar).</li>
	<li>Hazırlanan besiyerini kare Petri tabağına/plakalarına dökün ve besiyerinin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.</li>
</ol>2. Tohum yüzey sterilizasyonu ve bitki büyüme koşulları
<ol><li>Gerekli miktarda Arabidopsis thaliana Col-0 tohumunu stok balkından (10-20 mg) alın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. NOT: Farklı Arabidopsis hatlarıyla (ekotip/mutant hatlar) çalışırken belirli bir değişiklik gerekli değildir. Testere ızgarasının revizyonu ve ölçüm adımları, tohum büyüklüğü, çimlenme oranı ve fide büyüklüğündeki farklılıklar dikkate alınarak diğer bitki türleri için yapılmalıdır.</li>
	<li>Arabidopsis tohumlarını tüpe 2 dakika boyunca %70 etanol ekleyerek yüzey sterilize edin. Sterilizasyon sırasında tüpleri hafifçe sallayın.</li>
	<li>Etanolü dikkatlice pipetleyerek çıkarın, tohumları kaybetmemeye dikkat edin. Kalan etanolü çıkarmak için tüpe 5 dakika steril su ekleyerek tohumları yıkayın (yıkama süresi boyunca tüpleri hafifçe sallayın).</li>
	<li>Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.</li>
	<li>Herhangi bir etanol özelliğinden arınmış olduklarından emin olmak için tohumları adım 2.3'te açıklandığı gibi tekrar 2 kez steril suyla durulayın. Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.</li>
	<li>Bir tohum suyu süspansiyonu oluşturmak için tohumları içeren tüpe eşit miktarda steril su ekleyin.</li>
	<li>Verilen genotipin tohum-su süspansiyonunu orta plakanın seçilen alanlarına eşit olarak dağıtmak için bir ekim ızgarası kullanın (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Tohumları (yaklaşık 30-40) geniş bir pipet ucu kullanarak her alana arka arkaya dağıtın.</li>
	<li>Tohum alanlarında suyun yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin, kontaminasyonu önlemek için plaka(lar)ı laminer akış başlığında açık tutun. Plakayı mikro gözenekli bantla kapatın ve alüminyum folyo ile sarın.</li>
	<li>(Kullanılan ekotipe bağlı olarak) tohum uyku halinin üstesinden gelmek ve/veya homojen çimlenmeyi teşvik etmek için tohumları karanlıkta 3 gün boyunca 4 °C'de katmanlandırın.</li>
	<li>Tabakalı tohumlu plakayı beyaz ışığa (150 μmol/m2/s) 1 saat boyunca çimlenmeyi indüklemek için aktarın (folyoyu yalnızca ışık işlemi için açın).</li>
	<li>Işık işleminden sonra, tohumları ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile sarın ve bir büyüme odasına dikey bir konuma yerleştirin ve karanlıkta 21 ° C'de 4 gün boyunca yetiştirin.</li>
</ol>3. Klorofil floresan ölçümü ve analizi
<ol><li>iReenCAM sistemini açın ve sistemin hazır olduğundan ve otomatik olarak başlatılan PS sunucu yazılımında doğru şekilde yapılandırıldığından emin olun (örneğin, deney verileri için yeterli depolama alanı varsa, floresan kamera PC'ye bağlıysa vb.).</li>
	<li>Denemeler > Yeni Deneme'ye tıklayarak ölçüm için deney planı oluşturmak üzere Zamanlayıcı yazılımını etkinleştirin. Deneme için açıklayıcı bir ad girin ve ayrıntıları (açıklama) doldurun.</li>
	<li>Deneme eylemlerinin zamanlamasına yol açacak olan İşlem Ekle'yi tıklayarak deneme için gerekli eylemleri ayarlayın. NOT: Buradaki eylem kelimesi, tam bir deney yapmak anlamına gelir (yani, bir plaka ölçümü yapmak için gerekli tüm adımları içerir).</li>
	<li>Tek bir yuvarlak ölçüm için koşulları belirtin (yani, aydınlık/karanlık periyodunun uzunluğu).</li>
	<li>Liste Oluştur'a tıklayarak, ölçüm turları arasındaki zaman aralıklarını tanımlayın. Turun başlayacağı ve biteceği zamanı (toplam 4 saat) ve turlar arasındaki aralıkları (mevcut kurulumda her 2 dakikada bir tur) seçin.</li>
	<li>Oluştur'a tıklayın ve ekranın sol tarafında oluşturulan listeyi kontrol ederek ışık darbeleri arasındaki zaman çerçevesinin ve aralıkların doğru olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ölçüm protokolünü seçin (Ek Şekil 2). İleride başvurmak üzere tüm değişiklikleri veritabanına kaydedin.</li>
	<li>Ölçüm başlamadan hemen önce, karanlık odanın içinde düşük yoğunluklu yeşil ışık kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve folyoyu Petri plakasından çıkarmadan önce ölçüm odasının içindeki rafın seviyesini ayarlayın veya diğer hazırlık adımlarını gerçekleştirin. Ardından ışığı kapatın ve plakaları tamamen karanlıkta ölçüm odasına aktarın.</li>
	<li>4 günlük fideleri içeren Petri plakasını kaplayan alüminyum folyoyu dikkatlice çıkarın. Petri plakasını cihaz ölçüm odasının içine yatay olarak yerleştirin. Odanın içinde, aktinik ışık darbelerini indükleyin ve 3.1-3.7 adımlarında belirlenen deney planına (eylemlere) göre görüntüleme yapın. NOT: Plakaları ölçüm odasına yerleştirmeden önce etiollü fidelerle aydınlatılmaktan kaçınmak çok önemlidir. Etiollü fidelerin bulunduğu plaka ile manipülasyon karanlık odada/odada yapılmalıdır (olası bir deney düzeneği için Ek Şekil 3'e bakınız).</li>
</ol>4. Veri çıkarma ve analiz
<ol><li>Ölçümü tamamladıktan sonra, analizör yazılımında ilgili deneyi açın.</li>
	<li>Fidelerin floresansını analiz etmek için iki tür maske oluşturun - fidelerin bulunduğu alanı kaplayan kaba (tepsi) bir maske ve yalnızca ilgilenilen dokuyu (tipik olarak kotiledonlar) kaplayan hassas bir (bitki) maske.</li>
	<li>Yeni Tepsi Türü Oluştur seçeneğini tıklatarak bir tepsi maskesi oluşturun. Plaka görüntüsündeki ilgili alanlara uygun genotip adlarını atayın.</li>
	<li>Genotip atamak için, Yuvarlak'ta bir görüntü numarası seçin ve ardından ekranın üst kısmındaki Resmi Yükle'ye tıklayın. Plakanın görüntüsü ekranda gösterilecektir. Farklı şekiller çizim araçlarını temsil eden düğme setlerinden herhangi birine tıklayarak (Ek Şekil 4), plaka görüntüsünde ilgi alanını çizmeye izin veren Yeni Şekil Moduna girin. Gerekli alanları seçin (örneğin, plakadaki farklı genotipler) ve uygun isimlendirmelerini sağlayın.</li>
	<li>Şekil modundan çıkmak için Esc tuşuna tıklayın. Oluşturulan tepsi maskesini kaydedin (bir ad verdikten sonra) Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak.</li>
	<li>Bir adım geri gidin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinden adını seçerek önceki adımlarda oluşturulan maskeyi uygulayın.</li>
	<li>Bitki maskesini yüksek doğrulukla oluşturmak için, floresan sinyal yoğunluğu için minimum eşik değerini ayarlamak için 180 dakikalık ölçümden (yuvarlak 91) sonra elde edilen görüntüyü kullanın ve arka plan gürültüsünün çıkarılmasını sağlayın. Bunun için Otomatik Eşik'ten onay işaretini kaldırın ve Manuel Eşiği 0 olarak ayarlayın (Ek Şekil 4).</li>
	<li>Tepsi maskesinin plaka görüntüsündeki tüm gerekli alanları (genotipler) kapsadığından emin olmak için Önizleme'ye tıklayın. Bunun için 91. turu seçin ve Önizlemeyi Yenile'ye tıklayın.</li>
	<li>Çalıştır'a tıklayarak Çalıştır menüsüne girin. Sadece 91. turda bir onay işareti koyarak analizi yalnızca 91. tur için çalıştırın. Ardından çıkış yolunu seçin ve Analizi Başlat'a tıklayın.</li>
	<li>Analiz bittikten sonra Bitir menüsü otomatik olarak açılacaktır. Deneylerden yürütülen turu (tek tur olacaktır) seçin ve bu belirli zaman noktası (91. tur) için verileri dışa aktarmak için Analizörü Analiz Edilen Verilere Değiştir'e tıklayın.</li>
	<li>.xsel dosyasını dışa aktarılan arşivden ayıklayın, çünkü bu dosya Dışa Aktarma Bölümünü Aç simgesine tıklayarak temel bitki maskesi bilgilerini içerir.</li>
	<li>Yerel Analiz Bölümünü Aç simgesine tıklayarak denemeyi yeniden açın. Maske Oluşturucu menüsüne tekrar girin, Görüntü Yükle'ye tıklayın, yuvarlak 1'i seçin ve ardından ekranın sağ üst köşesindeki Dosyadan Yükle'yi seçin ve önceden çıkarılan .xsel dosyasını yükleyin. Tepsi maskesi uygulanmış olarak plakanın görüntüsü gösterilecektir.</li>
	<li>Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak maskeyi kaydedin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinde adını seçerek uygulayın.</li>
	<li>Floresan sinyal yoğunluğu eşiğini ayarlayarak bitki maskesini oluşturun. Önizleme menüsünde oluşturulan maske, genotiplerin her birindeki ROI'ye (örn. kotiledonlar) mükemmel şekilde uyana kadar Manuel Eşik değerini artırın (Ek Şekil 4). Önizleme menüsünde turlar boyunca kaydırarak maskenin ölçümlerin tüm turlarına uyup uymadığını kontrol edin (1, 61 ve 121. turlarda uygun maske konumunu kontrol etmek yeterli olacaktır).</li>
	<li>Tüm ölçüm turları için analiz gerçekleştirin ve verileri dışa aktarın. NOT: Çıktı dosyası, her bir zaman noktası için belirli bir genotipin klorofil floresan değerlerini içerir, bu da seçim çizelgelerinin oluşturulmasını sağlar ve daha fazla istatistiksel değerlendirmeyi kolaylaştırır.</li>
</ol>

Arabidopsis Fidesinde Klorofil Biyosentezinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

<ol>
	<li>Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomorphogenesis.">Photomorphogenesis.</a> Arabidopsis Book. 10, e0147 (2012).</li><li>Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+chlorophyll+biosynthesis--the+challenge+to+survive+photooxidation.">Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation.</a> Cell. 86 (5), 703-705 (1996).</li><li>Heyes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocatalysis+as+the+'master+switch'+of+photomorphogenesis+in+early+plant+development.">Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development.</a> Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).</li><li>Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+extraction+methods+that+prevent+the+artifactual+conversion+of+chlorophyll+to+chlorophyllide+during+pigment+isolation+from+leaf+samples.">Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples.</a> Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).</li><li>Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+estimation+of+chlorophyll+a,+b+and+carotenoid+content+by+deconvolution+of+the+absorption+spectrum+and+new+simultaneous+equations+for+chl+determination.">Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination.</a> Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).</li><li>Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+chlorophyll-a+and+chlorophyll-b+by+simultaneous+multicomponent+spectrophotometry.">Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry.</a> Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).</li><li>Balakhonova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ireencam:+Automated+imaging+system+for+kinetic+analysis+of+photosynthetic+pigment+biosynthesis+at+high+spatiotemporal+resolution+during+early+deetiolation.">Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation.</a> Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).</li><li>Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+chlorophyll+formation+in+relation+to+structural+changes+in+chloroplasts.">The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts.</a> Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).</li><li>Reinbothe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+biosynthesis:+Spotlight+on+protochlorophyllide+reduction.">Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction.</a> Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).</li><li>Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+arabidopsis+thaliana.">Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana.</a> Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).</li><li>Wang, Y., Folta, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+of+green+light+to+plant+growth+and+development.">Contributions of green light to plant growth and development.</a> Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).</li><li>Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+tetrapyrrole+biosynthesis+in+plants+and+algae.">Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae.</a> Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).</li><li>Pipitone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+analysis+reveals+two+distinct+phases+of+chloroplast+biogenesis+during+de-etiolation+in+arabidopsis.">A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis.</a> eLife. 10, e62709 (2021).</li><li>Stirbet, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relation+between+the+kautsky+effect+(chlorophyll+a+fluorescence+induction)+and+photosystem+ii:+Basics+and+applications+of+the+ojip+fluorescence+transient.">On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient.</a> J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).</li><li>Kupper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ojip+chlorophyll+fluorescence+kinetics+and+q(a)+reoxidation+kinetics+by+direct+fast+imaging.">Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging.</a> Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).</li><li>Avin-Wittenberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+the+role+of+autophagy+in+cellular+metabolism+and+energy+homeostasis+in+arabidopsis+seedlings+under+carbon+starvation.">Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation.</a> Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).</li><li>K&#243;sa, A., Preininger, &. #. 2. 0. 1. ;., B&#246;ddi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+deficiency+hinders+etioplast+development+in+stems+of+dark-grown+pea+(pisum+sativum)+shoot+cultures.">Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures.</a> Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).</li><li>Liang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+method+to+estimate+the+chlorophyll+content+of+arabidopsis+seedlings.">A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings.</a> Plant Met. 13 (1), 26 (2017).</li><li>P&#233;rez-Patricio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+method+for+estimating+the+chlorophyll+contents+in+plant+leaves.">Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves.</a> Sensors. 18 (2), 650 (2018).</li><li>Spyroglou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+models+as+a+tool+for+comparing+groups+of+time+series+in+plant+sciences.">Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences.</a> Plants (Basel). 10 (2), (2021).</li><li>Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapyrrole+metabolism+in+arabidopsis+thaliana.">Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana.</a> The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145 (2011).</li><li>De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+hormonal+regulation+of+plant+growth+and+development.">Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development.</a> Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).</li><li>Liu, X., Li, Y., Zhong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+light+and+plant+hormones+in+the+control+of+arabidopsis+seedling+chlorophyll+biosynthesis.">Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis.</a> Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).</li></ol>

Z.B. ve K.P. PSI'ın çalışanlarıdır ve Martin Trtilek, iReenCAM'i üreten PSI şirketinin CEO'su ve sahibidir. Tüm bu yazarlar, daha önce açıklandığı gibi enstrümanın geliştirilmesinde yer aldı7.

Protokolün kritik adımları ve sorun giderme - ışık yok ve maskeye dikkat edin Yukarıdaki protokol açıklamasında doğrudan vurgulandığı gibi, hem etiollenmiş bitki fidelerinin yetiştirilmesi sırasında hem de protokole başlamadan hemen önce eser miktarda ışıktan bile kaçınmak kritik öneme sahiptir11. Kurulumumuzda, içeri giren fitotronda bulunan ve fitotronun geri kalanından ışık geçirmez dönen kapı ile ayrılmış özel bir karanlık oda kullanı...

De-etiolasyon, bir dizi morfolojik değişiklik ve bitki metabolizmasının tamamen yeniden düzenlenmesi (hetero-tropikten oto-tropik)1 ile karakterize edilen bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamayı temsil eder. Klorofil biyosentezi, bitkilerde ışığa bağlı de-etiolasyonun ve çok dinamik bir sürecin ayırt edici özelliğidir. Koyu renkli üretilen öncü protoklorofilden klorofil oluşumu, reaktif yan ürünlerden kaynaklanan hasarı önlemek için sıkı bir şekilde koordine edilmelidir2. Protoklorofilidin klorofide indirgenmesi, doğrudan ışıkla aktive edilen benzersiz enzimler olan ışığa bağımlı protoklorofil oksidoredüktazlar (POR'lar) tarafından katalize edilir. Reaksiyon çok hızlıdır, ms ila s3 sırasına göre gerçekleşir ve etiollü fide ışınlamasından birkaç dakika sonratanınabilir klorofil birikimine yol açar 4,5,6. Kloroplast biyogenezinin tamamen işlevsel bir fotosentetik aparat oluşturması için daha fazla zaman (saatlerden günlere) gerekir3.
Klorofil içeriğini analiz etmek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) veya spektrofotometri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Genellikle, bu teknikler bitki dokusunun 4,5,6 tahrip edilmesini gerektirir ve zaman içinde klorofil seviyelerindeki değişikliklerin belirlenmesini kısıtlar. Non-invaziv klorofil kinetiğinin kurulmasına izin veren yöntemler, zaman ve mekanda klorofil sentezi sürecini analiz etmek gibi temel araştırma sorularından, stres toleransının değerlendirilmesi veya biyostimülanların klorofil kinetiği üzerindeki etkisi gibi daha pratik uygulamalara kadar çeşitli yönlerden bitkileri incelemek için yepyeni bir bakış açısı açabilir. Bunu göz önünde bulundurarak, klorofil oluşumunu izlemek için bir sistem olan iReenCAM7'yi tanıttık. Bir CCD kamera, emisyon filtreleri, ışık kaynakları ve otomatik floresan analizi için bir boru hattı içerir (Şekil 1). Geliştirilen cihazın temel özelliği, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük, mevcut yaklaşımlarda kullanılan parametrelerde daha iyi performans göstermesi ve standart analitik yöntemlerle karşılaştırıldığında yeterli hassasiyet ve özgüllüktür7.
Burada tarif edilen non-invaziv prosedür, minimum reaktifler gerektirir ve de-etiolasyonun çok erken aşamalarında canlı Arabidopsis fidelerinde bir klorofil kinetik profili elde edilmesine izin veren basit adımlardan oluşur. Protokol, hem eksojen (tuz, kuraklık, biyostimülanlar, ağır metaller, vb.) hem de endojen (tipik olarak gen aktivitesindeki değişikliklerle ilişkili) faktörlerden etkilenen klorofil sentezinin son derece dinamik sürecinin incelenmesi için yararlı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-benzylaminopurine</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>B0904.0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z691577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana Col-0 seeds</td>
			<td>NASC collection</td>
			<td>N1092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultivation chamber</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethilsulfoxid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>042780.AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 &#956;L)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>EP3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelrite</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iReenCAM device</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>custom made/prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z305170-10EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar-flow box</td>
			<td>UniGreenScheme</td>
			<td>ITEM-31156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch</td>
			<td>3M Science. Applied to Life</td>
			<td>7000006085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND</td>
			<td>Merck</td>
			<td>BR780546-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore tape</td>
			<td>3M Science. Applied to Life</td>
			<td>7100225115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osram lumilux green l18w/66</td>
			<td>Ovalamp</td>
			<td>200008833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z617679-240EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips, 1000 &#956;L, Axygen</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYT1000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Plant Screen Data Analyzer software</td>
			<td>PSI</td>
			<td></td>
			<td>delivered as a part of the iReenCAM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive assay for chlorophyll biosynthesis kinetics determination during early stages of arabidopsis de-etiolation

Klorofil biyosentezi, bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamalardan biri olan de-etiolasyonun ayırt edici özelliğidir. Sıkı bir şekilde kontrol edilen ve son derece dinamik olan klorofil biyosentezi süreci, çiçekli bitkilerde karanlıktan aydınlığa geçiş sırasında tetiklenir. Etiollü fidelerin güneş ışığının ilk izlerine maruz kaldığı anda, protoklorofilidin klorofilide hızlı (saniye sırasına göre) dönüşümüne, sonraki metabolik adımlarla tamamen işlevsel klorofil üretimine yol açan benzersiz ışık kabul eden protein kompleksleri aracılık eder. Klorofil içerik analizi için standart teknikler, bu tür hızlı işlemlerin incelenmesi için geçerli olmayan, ayrılmış bitki dokularından pigment ekstraksiyonunu içerir. Klorofil kinetiğini, ışık kaynaklı de-etiolasyondan sonraki ilk saatlerde yüksek doğruluk ve uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak araştırmak için bir alet ve protokol geliştirilmiştir. Burada, Arabidopsis de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofilin istatistiksel olarak sağlam miktar tayini için tasarlanmış ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz.

De-etiolation represents the most dramatic phase in the plant life cycle, characterized by a number of morphological changes and complete rearrangement of plant metabolism (from hetero- to auto-tropic)1. Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of light-induced de-etiolation in plants and a very dynamic process. Formation of chlorophyll from dark-produced precursor protochlorophyllide must be tightly coordinated to avoid damage due to reactive byproducts2. The protochlorophyllide reduction to chlorophyllide is catalyzed by light-dependent protochlorophyllide oxidoreductases (PORs), unique enzymes activated directly by light. The reaction is very fast, taking place in the order of ms to s3, leading to recognizable chlorophyll accumulation within minutes after etiolated seedling irradiation4,5,6. More time (from hours to days) is required for chloroplast biogenesis to establish a fully functional photosynthetic apparatus3.
Various methods exist to analyze chlorophyll content, including high-performance liquid chromatography (HPLC) or spectrophotometry. Usually, these techniques demand the destruction of plant tissue4,5,6, restricting the determination of changes in chlorophyll levels over time. Methods allowing non-invasive chlorophyll kinetics establishment may open a whole new perspective to study plants in diverse aspects ranging from fundamental research questions, such as analyzing the process of chlorophyll synthesis in time and space, to more practical applications, such as assessment of stress tolerance or effect of biostimulants on the chlorophyll kinetics. Considering this, we introduced a system for monitoring chlorophyll formation, iReenCAM7. It incorporates a CCD camera, emission filters, light sources, and a pipeline for automated fluorescence analysis (Figure 1). The main feature of the developed device is high spatial and temporal resolution, outperforming in the parameters used in current approaches, and sufficient sensitivity and specificity when compared with standard analytical methods7.
The non-invasive procedure described here requires minimum reagents and comprises simple steps, allowing to obtain a chlorophyll kinetics profile in living Arabidopsis seedlings during very early stages of de-etiolation. The protocol can be useful for the study of highly dynamic process of chlorophyl synthesis influenced by number of factors, both exogenous (salt, drought, biostimulants, heavy metals, etc.) and endogenous (typically associated with changes in the gene activity) in origin without a need to detach any plant tissue, thus avoiding additional stress.

Yazar Spotlight: De-etiolasyon sırasında klorofil sentezinin non-invaziv yüksek çözünürlüklü ölçümü

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Chlorophyll synthesis is a highly dynamic process. Therefore, the ability to measure it with high time and spatial resolution is necessary. We are proposing a highly accurate method that allows us to trace chlorophyll synthesis in vivo during the first hours of de-etiolation.Normally, chlorophyll is measured by high performance liquid chromatography or spectrophotometry. Also, new optical methods are being proposed for chlorophyll measurement. Chlorophyll synthesis is a very fast process that is triggered by minute traces of light in order of seconds.Recent approaches are mostly invasive, require tissue disintegration, making it difficult to accurately quantify the highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis as sufficient time resolution, We were able to determine chlorophyll kinetics in living etiolated seedlings after the first pulse of light, and during the next four hours with high time and spatial resolution. The high precision and statistical robustness of our approach allowed us to study the effects of various factors during individual stages of de-etiolation. It is a non-invasive method with high accuracy and spatial resolution, opening new opportunities for further research, including studies of the possible impact of stress or biostimulants.Thanks to its relatively high throughput, it can also be used in forward genetics to clarify the highly complex process of plant de-etiolation.

Yabani tip (WT), ekotip Columbia-0 (Col-0) 4 günlük etiolasyondan arındırılmış Arabidopsis fidelerinde yeni geliştirilen prosedür kullanılarak elde edilen tipik çıktı Şekil 3'te gösterilmektedir. Kontrol koşulları altında (DMSO takviyeli MS ortamı), klorofil biyosentetik eğrisi, büyümenin skotomorfojenik fazı sırasında sentezlenen protoklorfilid havuzunun, ışıkla indüklenen POR'lar 7,8,9</su...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation at JoVE.com

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

Klorofil sentezi oldukça dinamik bir süreçtir. Bu nedenle, yüksek zaman ve uzamsal çözünürlükle ölçme yeteneği gereklidir. De-etiolasyonun ilk saatlerinde in vivo klorofil sentezini izlememize izin veren oldukça hassas bir yöntem öneriyoruz.Normalde klorofil, yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya spektrofotometri ile ölçülür. Ayrıca, klorofil ölçümü için yeni optik yöntemler önerilmektedir. Klorofil sentezi, saniyeler mertebesinde çok küçük ışık izleri ile tetiklenen çok hızlı bir süreçtir.Son yaklaşımlar çoğunlukla invazivdir, doku parçalanmasını gerektirir, bu da klorofil biyosentezinin son derece dinamik sürecini yeterli zaman çözünürlüğü olarak doğru bir şekilde ölçmeyi zorlaştırır, İlk ışık darbesinden sonra canlı etiollü fidelerde klorofil kinetiğini belirleyebildik ve sonraki dört saat boyunca yüksek zaman ve uzamsal çözünürlükle. Yaklaşımımızın yüksek kesinliği ve istatistiksel sağlamlığı, etiolasyonun bireysel aşamalarında çeşitli faktörlerin etkilerini incelememizi sağladı. Yüksek doğruluk ve uzamsal çözünürlüğe sahip, invaziv olmayan bir yöntemdir ve stres veya biyostimülanların olası etkilerine ilişkin çalışmalar da dahil olmak üzere daha fazla araştırma için yeni fırsatlar sunar.Nispeten yüksek verimi sayesinde, son derece karmaşık bitki de-etiolasyon sürecini açıklığa kavuşturmak için ileri genetikte de kullanılabilir.

non-invasive-assay-for-chlorophyll-biosynthesis-kinetics

Research

JoVE Journal

Biology

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

478 Görüntüleme.  Masaryk University. Klorofil sentezi oldukça dinamik bir süreçtir. Bu nedenle, yüksek zaman ve uzamsal çözünürlükle ölçme yeteneği gereklidir. De-etiolasyonun ilk saatlerinde in vivo klorofil sentezini izlememize izin veren oldukça hassas bir yöntem öneriyoruz.Normalde klorofil, yüksek performanslı sıvı kromatografisi veya spektrofotometri ile ölçülür. Ayrıca, klorofil ölçümü için yeni optik yöntemler önerilmektedir. Klorofil sentezi, saniyeler mertebesinde çok küçük ı?...

Video: Yazar Spotlight: De-etiolasyon sırasında klorofil sentezinin non-invaziv yüksek çözünürlüklü ölçümü

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.