LM, LDM e DT reconhecem o apoio do Conselho Europeu de Pesquisa (ERC) no âmbito do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). O LDM reconhece o apoio de uma bolsa de pesquisa da Royal Society para bolsistas de pesquisa (RGF / R1 / 180043) e o apoio de uma bolsa de pesquisa da Royal Society University (UF160152, URF / R / 221009).

NOTA: O protocolo é dividido em três seções. A Seção 1 descreve as etapas de pré-requisito, incluindo a preparação de oligonucleotídeos de DNA e capilares de vidro. A Seção 2 descreve a preparação de condensados de estrela C de vários projetos, incluindo projetos de um e dois componentes, e sua extração dos capilares de vidro. A Seção 3 descreve o uso de condensados de estrela C de modelagem de RNA de um componente para a síntese de um aptâmero de RNA. O usuário deve seguir as boas práticas de laboratório o tempo todo, garantir que todas as avaliações e mitigações de risco necessárias estejam em vigor e usar equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo luvas, óculos de segurança e jaleco. A limpeza dos tubos capilares de vidro requer sua sonicação, primeiro em uma solução surfactante e depois em isopropanol ou etanol. A extração de condensados de estrela C de tubos capilares requer o uso de uma caneta de riscagem de diamante para marcar e quebrar o vidro, com um risco associado de ferimentos causados por fragmentos de vidro. Os principais materiais, equipamentos e reagentes usados estão listados na Tabela de Materiais. A maioria dos oligonucleotídeos não funcionalizados é purificada pelo fornecedor usando dessalinização padrão, com exceção das fitas "núcleo estendido 1" e "modelo de Aptâmer", que são solicitadas com purificação por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Os oligonucleotídeos modificados com colesterol são purificados pelo fornecedor usando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) de fase reversa.
1. Pré-requisitos
NOTA: As seguintes soluções devem ser preparadas em água ultrapura (Tipo I) e filtradas com filtros de seringa de 0,22 μm: Tampão Tris-EDTA (TE), compreendendo 10 mM Tris, 1 mM EDTA, a pH ~ 8,0; Tampão TE suplementado com NaCl 2 M; e tampão TE suplementado com NaCl 0,3 M. As soluções-tampão devem ser utilizadas no prazo de 2 semanas após a preparação e conservadas a 4 °C quando não estiverem a ser utilizadas. Além disso, uma solução de 1 vol% de detergente óptico alcalino em água ultrapura será usada para limpar os capilares de vidro.
<ol><li>Preparação de oligonucleotídeos de DNA do estado liofilizado<ol><li>Centrifugue brevemente (2000 x g por 10-30 s) os tubos de oligonucleotídeos de DNA liofilizado para garantir que os pellets de DNA liofilizado se acumulem no fundo. NOTA: A centrifugação é feita à temperatura ambiente (RT) por 10-30 s. A mini centrífuga usada aqui tem como padrão 2000 x g (6000 rpm).</li>
		<li>Adicione a quantidade apropriada de tampão TE para reconstituir cada oligonucleotídeo a 100 μM. Vortex completamente para garantir a dissolução completa e, em seguida, gire os tubos para coletar todo o líquido conforme a etapa 1.1.1.</li>
		<li>Para cada solução-mãe, medir a absorvância a 260 nm e calcular a concentração final utilizando o coeficiente de extinção da sequência de oligonucleótidos em ensaio. NOTA: O coeficiente de extinção para uma determinada sequência de oligonucleotídeos geralmente é encontrado na folha de dados do fornecedor, mas também pode ser calculado com ferramentas on-line usando o modelo de vizinho mais próximo35 ou valores tabulados do coeficiente de extinção de nucleotídeos individuais36.</li>
		<li>Conservar os oligonucleótidos reidratados a 4 °C durante curtos períodos de tempo (até 1 semana) ou a -20 °C para armazenamento a longo prazo (até 6 meses).</li>
	</ol></li>
	<li>Limpeza de tubos capilares de vidro<ol><li>Sonicate em detergente ótico alcalino a 1% para componentes óticos em água desionizada.<ol><li>Pegue o número necessário de tubos capilares de vidro a serem limpos e coloque-os em um recipiente alto e estreito (por exemplo, um béquer ou um tubo de centrífuga de 15/50 mL) de forma que os capilares não fiquem planos na base do recipiente.</li>
			<li>Adicione o detergente ao recipiente, enchendo-o logo acima do nível dos tubos capilares. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presas dentro dos tubos capilares - toque para remover, se necessário. Cubra frouxamente o recipiente (por exemplo, em papel alumínio ou usando a tampa do tubo da centrífuga, certificando-se de que não esteja bem fechado).</li>
			<li>Defina um banho-maria de sonicação para 40 °C, coloque o recipiente coberto na vertical no banho e sonice por 30 min. Certifique-se de que a folha, se usada, não entre em contato com a água do banho de sonicação. NOTA: O banho de sonicação usado neste estudo tem como padrão uma frequência de sonicação de 60 Hz e uma potência de sonicação de 150 W. CUIDADO: Nunca adicione ou remova itens de um banho de sonicação durante a corrida; Sempre pause o protocolo primeiro.</li>
			<li>Quando a sonicação estiver concluída, desligue o elemento de aquecimento do banho-maria sonicante e, em seguida, enxágue bem os capilares do recipiente com água deionizada ou ultrapura - no mínimo cinco vezes, descartando a água de enxágue a cada vez.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sonicar em isopropanol ou etanol.<ol><li>Nos tubos capilares de vidro no recipiente de limpeza, adicione isopropanol ou etanol (mínimo 70%), enchendo até um pouco acima do nível dos tubos capilares. Como na etapa 1.2.1.2, certifique-se de que não haja bolhas de ar presas nos tubos capilares e cubra frouxamente o recipiente.</li>
		<li>Coloque o recipiente na vertical no banho de sonicação e sonice por 15-30 min. CUIDADO: Isopropanol e etanol são inflamáveis, com pontos de fulgor abaixo de RT. Minimize os volumes de solventes usados durante a limpeza escolhendo um recipiente de tamanho apropriado, certifique-se de que os recipientes estejam frouxamente cobertos e não deixe o banho de sonicação sem vigilância durante este stage.</li>
		<li>Quando a sonicação estiver completa, descarte adequadamente o isopropanol ou etanol e seque os capilares sob nitrogênio, manuseando-os com um tecido sem fiapos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação e extração de condensados de estrela C (Figura 2)
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig02.jpg"> Figura 2: Carregamento de misturas de estrelas C e extração de condensados de tubos capilares de vidro. Em todos os painéis, a mistura C-star foi substituída por uma solução aquosa de calceína 25 mM para ajudar na visibilidade. (A-E) Principais etapas, em ordem, a serem tomadas antes do recozimento, correspondendo às seções 2.1 e 2.2 do protocolo. (F-J) Principais etapas, em ordem, a serem seguidas após o recozimento, correspondendo à seção 2.3 do protocolo. Durante a extração (painéis (I-J)), os condensados de DNA sedimentarão do capilar para o reservatório tampão, desde que o tubo da microcentrífuga seja armazenado verticalmente. Os condensados não serão visíveis a olho nu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Preparação de misturas C-star para condensados monocomponentes NOTA: Os detalhes da sequência para vários projetos de componentes individuais podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1 e em trabalhos anteriores 29,30,32. Os protocolos de recozimento lento definidos nas etapas 2.1.9 e 2.2.2 foram desenvolvidos para garantir o relaxamento das redes de nanoestrelas em morfologias compactas, dadas as propriedades reológicas fortemente dependentes da temperatura das redes de nanoestrelas37.<ol><li>Os componentes de oligonucleotídeos e tampão variam dependendo do design de estrela C desejado. Prepare uma mistura de 60 μL de condensados de estrela C de componente único na concentração de 5 μM para a estrela C de quatro braços não responsiva, a estrela C responsiva a TMSD ou a estrela C de modelagem de RNA.</li>
		<li>Para cada projeto, pipetar os componentes apropriados listados na Tabela Suplementar 2 em um tubo de microcentrífuga separado e misturar bem por pipetagem. NOTA: Presume-se que todas as soluções de estoque de oligonucleotídeos estejam na concentração de 100 μM em TE.</li>
		<li>Retire todos os 60 μL de solução C-star e pipete cuidadosamente para injetar a mistura no tubo capilar de vidro limpo e seco, conforme mostrado na Figura 2A, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar.</li>
		<li>Usando uma pipeta, injete aproximadamente 9-12 μL de óleo mineral em cada extremidade do tubo capilar, tampando a amostra de forma que não haja interface livre entre a solução C-star e o ar (ver Figura 2B). Em seguida, seque cuidadosamente o tubo capilar com papel de seda para garantir que nenhum óleo esteja presente na parte externa dele (Figura 2C), tomando cuidado para não absorver óleo mineral ou solução C-star do tubo capilar. O resultado final é demonstrado na Figura 2D.</li>
		<li>Prepare um pequeno lote de cola epóxi de duas partes para aderir cada extremidade do tubo capilar, com o lado plano para baixo, a uma lamínula de vidro. Certifique-se de que as aberturas do tubo estejam completamente cobertas com cola, formando uma vedação contínua, conforme mostrado na Figura 2E.</li>
		<li>Reserve para curar por no mínimo 3 h, mas de preferência durante a noite.</li>
		<li>Após ~30 min de cura, inspecione a camada de cola quanto à presença de lacunas na vedação causadas por bolhas de ar. Se estiverem presentes, sele-os com uma pequena quantidade de cola.</li>
		<li>Enrole o tubo capilar colado à lamínula em papel alumínio, garantindo que o papel alumínio seja mantido plano na parte inferior da lamínula de vidro. A folha garante um bom contato térmico entre o mesmo e o elemento de aquecimento do termociclador (veja o próximo passo).</li>
		<li>Coloque a amostra embrulhada em um termociclador e recoze usando o seguinte protocolo: Mantenha a 95 ° C por 30 min, depois resfrie de 85 ° C a 50 ° C a -0,04 ° C · min-1 e, em seguida, resfrie de 50 ° C a RT a -0,5 ° C · min-1.<ol><li>Armazene os condensados C-star recozidos a 4 ° C ou RT por longos períodos (meses), desde que o capilar permaneça selado, pois o recozimento térmico esteriliza efetivamente a amostra e desnatura as nucleases. Mantenha o capilar plano durante o armazenamento e manuseio para evitar que os condensados sedimentem em uma extremidade e se agreguem.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de misturas de estrelas C para condensados binários NOTA: Para informar a seleção de populações de estrelas C para sistemas binários, consulte o trabalho de Malouf et al., que descreve as regras de projeto e o comportamento de fase esperado de condensados binários de estrelas C30.<ol><li>Para preparar condensados binários, combine volumes de 30 μL das misturas C-star descritas na etapa 2.1 acima com um volume total de 60 μL, misture bem, carregue nos capilares e siga as etapas 2.1.4-2.1.8.</li>
		<li>Coloque a amostra embrulhada em um termociclador e recoze usando o seguinte protocolo: Mantenha a 95 ° C por 30 min, depois resfrie de 85 ° C a 40 ° C a -0,01 ° C · min-1 e, em seguida, resfrie de 40 ° C a RT a -0,1 ° C · min-1.</li>
	</ol></li>
	<li>Extração de condensados de estrela C de tubos capilares.<ol><li>Prepare um tubo de microcentrífuga grande (1,5 mL ou 2,0 mL) contendo 60 μL de NaCl 0,3 M em tampão TE.</li>
		<li>Desembrulhe a amostra capilar e use uma caneta de diamante para marcar a parte inferior da lamínula em cada extremidade interna da área colada (Figura 2F). Quebre a lamínula nesta região e descarte adequadamente.</li>
		<li>Limpe bem os tubos capilares com etanol e seque.</li>
		<li>Marque cada extremidade dos tubos capilares com a caneta de riscagem de diamante, primeiro com a parte inferior (Figura 2G), depois virando e marcando os tubos "com o lado direito para cima".<ol><li>Certifique-se de que as linhas de pontuação não se sobrepõem à interface óleo-água. Devem estar dentro da região aquosa para evitar que o óleo permaneça na amostra extraída.</li>
		</ol></li>
		<li>Retire as extremidades dos tubos capilares (Figura 2H), retendo a parte central do tubo e descartando o restante. Coloque o tubo capilar cortado no tubo de microcentrífuga preparado na etapa 2.3.1, certificando-se de que o fundo do tubo capilar entre em contato com a solução tampão (Figura 2I).</li>
		<li>Os condensados sedimentarão do tubo para o reservatório tampão por gravidade; permita que isso ocorra por um mínimo de 10 min (Figura 2J). Remova o tubo capilar cortado e descarte-o adequadamente. Essa abordagem de extração suave limita o risco de agregação de condensado.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Transcrição de um aptâmero de RNA a partir de condensados de estrela C de modelagem de RNA
NOTA: Para a produção do aptâmero de RNA de brócolis, é necessária uma solução de difluoro-4-hidroxibenzilideno imidazolidinona (DFHBI) - o pó de DFHBI é primeiro preparado como uma solução estoque a 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), que é então diluído a 600 μM em água livre de RNase e DNase.
<ol><li>Lavagem de condensados de estrela C de modelagem de RNA NOTA: Os condensados de estrela C com modelagem de RNA são lavados três vezes para garantir que os oligonucleotídeos molde não ligados sejam removidos.<ol><li>Deixe a solução de condensados extraídos repousar durante pelo menos 5 minutos e, em seguida, retire cerca de metade do volume do sobrenadante.<ol><li>Para um volume de 60 μL de condensados extraídos, remova entre 25-30 μL do sobrenadante.</li>
			<li>Pipete a partir do topo do nível do líquido para minimizar o número de condensados removidos durante esta etapa.</li>
		</ol></li>
		<li>Adicione o mesmo volume de NaCl 0,3 M em TE para substituir o sobrenadante removido e misture por pipetagem.</li>
		<li>Repita as duas etapas anteriores para um total de três ciclos.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da mistura de transcrição T7 NOTA: A mistura de transcrição T7 é preparada usando o kit de transcrição CellScript T7-FlashScribe. A etapa 3.2.2 é uma modificação do protocolo do fabricante, que pode ser encontrada aqui38. Aqui descrevemos a transcrição do aptâmero de RNA de brócolis, que induz fluorescência em DFHBI após a ligação. Para outros aptâmeros iluminados, substitua o volume de DFHBI descrito na etapa 3.2.2 pelo fluorogênio apropriado. Para outras transcrições, remova esse componente completamente.<ol><li>Preparar uma solução-mãe de 10 mM de DFHBI em DMSO e, em seguida, diluir uma alíquota até obter uma concentração final de 600 μM utilizando água isenta de RNase e DNase.</li>
		<li>Descongele os componentes do kit de transcrição em gelo e, em seguida, pipete o seguinte em um tubo de microcentrífuga autoclavado à temperatura ambiente usando pontas de pipeta estéreis: 2 μL de tampão de transcrição 10x T7 (fornecido no kit de transcrição), 1,8 μL de 100 mM ATP, 1,8 μL de 100 mM CTP, 1,8 μL de 100 mM UTP, 2 μL de DTT 100 mM, 2 μL de DFHBI 600 μM, 0,5 μL de inibidor de RNase, 2 μL de solução enzimática T7 (fornecida no kit de transcrição).</li>
		<li>Misture suavemente a solução pipetando.</li>
		<li>Use a mistura de transcrição para a etapa 3.3 (síntese do transcrito de RNA) imediatamente após a preparação.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese de transcrição de RNA<ol><li>Em uma câmara adequada para imagens de microscopia, pipetar 3,3 μL dos condensados lavados preparados a partir de estrelas C de modelagem de RNA e adicionar o volume total da mistura de transcrição preparada anteriormente.</li>
		<li>Adquirir imagens microscópicas durante 18 h, começando imediatamente após a adição da mistura de transcrição aos condensados. NOTA: As configurações de microscopia dependerão do sistema preparado. Certifique-se de que as configurações apropriadas de excitação e emissão sejam usadas para quaisquer fluoróforos na amostra, juntamente com tempos de exposição que não levarão à saturação à medida que a transcrição avança. Como em qualquer lapso de tempo, deve-se encontrar um compromisso entre um laser ou LED alto o suficiente para um bom sinal, ao mesmo tempo em que minimiza o risco de fotobranqueamento. O fotobranqueamento por longos períodos de tempo será minimizado em sistemas baseados em LED em comparação com sistemas baseados em laser. Intervalos de imagem sugeridos: 20 min nas primeiras 2 h e 30 min subsequentes.</li>
	</ol></li>
</ol>

Condensados Biomoleculares Versáteis de Nanoestrelas de DNA Anfifílico ou Estrelas C

<ol>
	<li>Buddingh', B. C., Hest, J. C. M. v. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Fanalista, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+and+size+control+of+artificial+cells+for+bottom-up+biology.">Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology.</a> ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).</li><li>Dora Tang, T. -. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-controlled+adhesion+and+microemulsification+in+a+two-phase+system+of+DNA+liquid+droplets.">Sequence-controlled adhesion and microemulsification in a two-phase system of DNA liquid droplets.</a> J Phys Chem. 124 (40), 8888-8895 (2020).</li><li>Sato, Y., Sakamoto, T., Takinoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-based+engineering+of+dynamic+functions+of+micrometer-sized+DNA+droplets.">Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets.</a> Sci Adv. 6 (23), 3471 (2020).</li><li>Saleh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vacuole+dynamics+and+popping-based+motility+in+liquid+droplets+of+DNA.">Vacuole dynamics and popping-based motility in liquid droplets of DNA.</a> Nat Commun. 14 (1), 3574 (2023).</li><li>Rubio-S&#225;nchez, R., Fabrini, G., Cicuta, P., Michele, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic+DNA+nanostructures+for+bottom-up+synthetic+biology.">Amphiphilic DNA nanostructures for bottom-up synthetic biology.</a> Chem Commun. 57 (95), 12725-12740 (2021).</li><li>Brady, R. A., Brooks, N. J., Cicuta, P., Di Michele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+amphiphilic+DNA+C-Stars.">Crystallization of amphiphilic DNA C-Stars.</a> Nano Lett. 17 (5), 3276-3281 (2017).</li><li>Leathers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction-diffusion+patterning+of+DNA-based+artificial+cells.">Reaction-diffusion patterning of DNA-based artificial cells.</a> J Am Chem Soc. 144 (38), 17468-17476 (2022).</li><li>Malouf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sculpting+DNA-based+synthetic+cells+through+phase+separation+and+phase-targeted+activity.">Sculpting DNA-based synthetic cells through phase separation and phase-targeted activity.</a> Chem. 9 (11), 3347-3364 (2023).</li><li>Fabrini, G., Minard, A., Brady, R. A., Antonio, M. D., Michele, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cation-responsive+and+photocleavable+hydrogels+from+noncanonical+amphiphilic+DNA+nanostructures.">Cation-responsive and photocleavable hydrogels from noncanonical amphiphilic DNA nanostructures.</a> Nano Lett. 22 (2), 602-611 (2022).</li><li>Brady, R. A., Brooks, N. J., Foder&#224;, V., Cicuta, P., Di Michele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphiphilic-DNA+platform+for+the+design+of+crystalline+frameworks+with+programmable+structure+and+functionality.">Amphiphilic-DNA platform for the design of crystalline frameworks with programmable structure and functionality.</a> J Am Chem Soc. 140 (45), 15384-15392 (2018).</li><li>Walczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+core-shell+DNA+particles+trigger+lipid-membrane+disruption+and+bacteria+entrapment.">Responsive core-shell DNA particles trigger lipid-membrane disruption and bacteria entrapment.</a> Nat Commun. 12 (1), 4743 (2021).</li><li>Zhang, D. Y., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+DNA+strand+displacement+kinetics+using+Toehold+exchange.">Control of DNA strand displacement kinetics using Toehold exchange.</a> J Am Chem Soc. 131 (47), 17303-17314 (2009).</li><li>. Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Available from: <a target="_blank" href="https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos">https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos</a> (2024)</li><li>Cavaluzzi, M. J., Borer, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+UV+extinction+coefficients+for+nucleoside-5'-monophosphates+and+unpaired+DNA+and+RNA.">Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5'-monophosphates and unpaired DNA and RNA.</a> Nucleic Acids Res. 32 (1), e13 (2004).</li><li>Lattuada, E., Caprara, D., Piazza, R., Sciortino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+uniform+dynamics+in+equilibrium+colloidal+gels.">Spatially uniform dynamics in equilibrium colloidal gels.</a> Sci Adv. 7 (49), (2021).</li><li>. T7-FlashScribeTM Transcription Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf">https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf</a> (2017)</li><li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUPACK:+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems.">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> J Comput Chem. 32 (1), 170-173 (2011).</li><li>Walczak, M., Brady, R. A., Leathers, A., Kotar, J., Di Michele, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+hydrophobic+moieties+on+the+crystallization+of+amphiphilic+DNA+nanostructures.">Influence of hydrophobic moieties on the crystallization of amphiphilic DNA nanostructures.</a> The Journal of Chemical Physics. 158 (8), 084501 (2023).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo descrito aqui fornece uma abordagem para a preparação de condensados de um ou dois componentes a partir de nanoestrelas de DNA anfifílico, com variações de design para introduzir diferentes respostas nos condensados. O protocolo fornecido produz condensados em uma solução tampão de NaCl 0,3 M em TE, mas as condições tampão podem ser alteradas modificando adequadamente os volumes listados acima. Trabalhos anteriores estudaram a formação de condensados C-star em 0,2 M NaCl em TE e 0,1 M NaCl em TE ...

As células sintéticas são dispositivos em escala micrométrica (10-50 μm) construídos de baixo para cima para replicar funções e estruturas de células biológicas existentes 1,2. As células sintéticas são frequentemente ligadas por membranas construídas a partir de vesículas de bicamada lipídica 3,4,5,6,7, polimerossomos 8,9 ou proteinossomos10,11, que também podem ser usados para estabelecer compartimentalização interna12,13. Inspiradas nas organelas sem membrana conhecidas por sustentar várias funcionalidades em células vivas14, estruturas como coacervados poliméricos, condensados biomoleculares e hidrogéis estão ganhando força como alternativas versáteis e robustas para estabelecer compartimentalização externa e interna em células sintéticas 15,16,17,18.
Aproveitando o versátil kit de ferramentas da nanotecnologia de DNA19, várias soluções foram desenvolvidas para projetar gotículas e condensados sintéticos a partir da automontagem de nanoestruturas artificiais de DNA, cujo tamanho, forma, funcionalidade, valência e interações mútuas podem ser programados com precisão20. Gotículas ou condensados de DNA são biocompatíveis e podem atuar como andaimes para células sintéticas e organelas, hospedando reações químicas e biomoleculares21, computando informações22,23, capturando e liberando cargas24,25 e sustentando respostas estruturais26.
Entre os diversos projetos de nanoestruturas de DNA formadoras de condensado, as nanoestrelas de DNA anfifílicas - apelidadas de estrelas C - provaram ser robustas e versáteis27. As estrelas C são motivos ramificados simples que consistem em uma junção fixa de DNA (normalmente de quatro vias), da qual emergem braços de DNA de fita dupla (ds)28. Os braços são então derrubados com porções hidrofóbicas, normalmente colesterol, tornando as nanoestruturas anfifílicas e conduzindo sua condensação após um simples recozimento de um pote. Os condensados C-star oferecem programabilidade estrutural e funcional precisa, incluindo a possibilidade de estabelecer arquiteturas multicompartimentais29,30, respondendo estruturalmente a gatilhos de DNA e cátions31, sintetizando macromoléculas29, capturando e liberando cargas úteis32 e interagindo com células vivas33. Abaixo, descreveremos e discutiremos protocolos para produzir condensados de estrela C a partir de seus oligonucleotídeos constituintes.
O protocolo resume a preparação de condensados unários (um componente) e binários (dois componentes), utilizando três designs diferentes de C-star (Figura 1) - "Não responsivo", "TMSD-responsivo" e "Modelagem de RNA". A estrela C "não responsiva" (painel A) consiste em quatro "fitas centrais" com sequências distintas formando a junção de quatro vias. Quatro oligonucleotídeos idênticos modificados por colesterol estão conectados à junção, garantindo que uma molécula de colesterol esteja presente no final de cada braço. As estrelas C não responsivas constituem andaimes simples e inertes para condensados unários e binários. Na estrela C "responsiva a TMSD" (painel B), a conexão entre as fitas colesterolizadas e a junção é garantida por uma fita "Toeholding bridge", que apresenta um domínio "toehold" de fita simples (ss) DNA. Na presença de uma fita de DNA invasora com um domínio de toehold complementar, uma reação de deslocamento da fita mediada pelo toehold pode ser desencadeada34, em que o invasor desloca a ponte Toeholding, quebrando a conexão entre a junção e as porções hidrofóbicas e desencadeando a desmontagem da rede de DNA32. Finalmente, a estrela C de "modelagem de RNA" (painel C) inclui uma modificação de "Base" complementar a uma fita de "Ponte", a última das quais liga o modelo de ssDNA transcritível para o aptâmero de brócolis29. Detalhes da sequência dos oligonucleotídeos constituintes para os três tipos de projetos de estrelas C mencionados aqui podem ser encontrados na Tabela Suplementar 1 e em trabalhos anteriores 29,30,32.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig01v2.jpg"> Figura 1. Esquemas de três designs diferentes de nanoestrelas de DNA anfifílico (estrelas C). Sequências de oligonucleotídeos para vários exemplos de estrelas C descritas aqui podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. (A) Esquema de uma estrela C projetada para formar condensados não responsivos, com as fitas de oligonucleotídeos componentes "Núcleo 1", "Núcleo 2", "Núcleo 3", "Núcleo 4" (colorido em tons de rosa) e "Colesterol terminal" (colorido em azul). Cada cor única representa uma fita de oligonucleotídeo de sequência única. "Núcleo 1" e "Núcleo 3" são parcialmente complementares a "Núcleo 2" e "Núcleo 4", mas não complementares entre si. (B) Esquema de uma estrela C projetada para se desmontar após a adição de uma fita invasora por meio do deslocamento da fita mediada pelo apoio do pé, conforme descrito no trabalho anterior32. Esta estrela C é composta por fitas "Core" e "Colesterol terminal" (coloridas em cinza), bem como uma fita "Complemento terminal" (mostrada em laranja) e uma fita "Toeholding bridge" (mostrada em azul-petróleo escuro). Este último contém uma saliência de seis nucleotídeos à qual uma fita invasora adequadamente projetada pode se ligar e, subsequentemente, deslocar totalmente a fita "Toeholding bridge", que causa a dissociação da junção central da nanoestrela (composta por "Core 1, 2, 3 e 4") dos duplexes compostos pelas fitas "Complemento terminal" e "Colesterol terminal". (C) Esquema de uma estrela C funcionalizada com um molde de DNA para um aptâmero de RNA. Este também é composto pela fita "Colesterol terminal" e "Núcleo 2, 3 e 4" (todos mostrados em cinza), bem como uma versão estendida da fita "Núcleo 1" (mostrada em rosa), uma fita "Base" (marrom), uma fita "Ponte" (amarelo) e o "Modelo de Aptâmero" (verde). O duplex de DNA composto pelas duas últimas fitas forma a região promotora da polimerase T7, que marca o local de início da transcrição. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os condensados C-star se formam após o recozimento térmico dos oligonucleotídeos constituintes, que no protocolo aqui apresentado é conduzido dentro de capilares de vidro selados com uma seção transversal retangular de alta proporção. Esses recipientes oferecem várias vantagens principais: i) A vedação garante que a evaporação seja completamente evitada nas etapas de recozimento (às vezes lentas); ii) O fundo plano de qualidade óptica dos capilares permite a obtenção de imagens do transiente de automontagem (ou desmontagem); iii) a alta proporção dos capilares garante que os condensados pesados se depositem em uma área ampla e plana, reduzindo as chances de coalescência e agregação em estágios posteriores do transiente de automontagem que ocorreria em recipientes em forma de cunha (por exemplo, tubos de microcentrífuga) e produzindo populações de condensado relativamente monodispersas; iv) realizar o recozimento em um capilar de vidro alongado minimiza a exposição da amostra a interfaces hidrofóbicas (ar, plástico ou óleo), que foram observadas perturbando a automontagem ao recrutar os oligonucleotídeos anfifílicos colesterolizados. Uma vez concluído o protocolo de montagem, os condensados podem ser extraídos dos capilares de vidro para experimentos adicionais que envolvem reagentes adicionais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLGVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-08895-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue</td>
			<td>RS</td>
			<td>ARA-400005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad C1000 thermal cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15338665</td>
			<td>2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Scribing Pen</td>
			<td>RS</td>
			<td>394-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0030123301</td>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute 99.8+%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437341</td>
			<td>70% ethanol is sufficient for cleaning purposes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13284769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hellmanex III</td>
			<td>Hellma</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length</td>
			<td>CM Scientific</td>
			<td>2540-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>69794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Centrifuge, 230 V</td>
			<td>PRISM(TM)</td>
			<td>Z763128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom</td>
			<td>Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScriptGuard RNase inhibitor</td>
			<td>CELLSCRIPT</td>
			<td>C-SRI6310K</td>
			<td>RNase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7-FlashScribe Transcription Kit</td>
			<td>Cambio</td>
			<td>C-ASF3507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer, 100x stock solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>574793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Spec-Wipe 3 Wipers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21914-758</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic condensates and cell-like architectures from amphiphilic dna nanostructures

Gotículas e condensados sintéticos estão se tornando constituintes cada vez mais comuns de sistemas biomiméticos avançados e células sintéticas, onde podem ser usados para estabelecer compartimentalização e sustentar respostas semelhantes à vida. As nanoestruturas de DNA sintético demonstraram potencial significativo como blocos de construção formadores de condensado devido à sua forma programável, funcionalização química e comportamento de automontagem. Recentemente, demonstramos que as "nanoestrelas" de DNA anfifílico, obtidas pela marcação de junções de DNA com porções hidrofóbicas, constituem uma solução particularmente robusta e versátil. Os condensados de DNA anfifílicos resultantes podem ser programados para exibir arquiteturas internas complexas e multicompartimentais, responder estruturalmente a vários estímulos externos, sintetizar macromoléculas, capturar e liberar cargas úteis, sofrer transformações morfológicas e interagir com células vivas. Aqui, demonstramos protocolos para a preparação de condensados de DNA anfifílicos a partir de oligonucleotídeos de DNA constituintes. Abordaremos (i) sistemas monocomponentes formando condensados uniformes, (ii) sistemas de dois componentes formando condensados núcleo-casca e (iii) sistemas nos quais os condensados são modificados para suportar a transcrição in vitro de nanoestruturas de RNA.

Synthetic cells are micrometer-scale (10-50 &#181;m) devices constructed from the bottom-up to replicate functions and structures of extant biological cells1,2. Synthetic cells are often bound by membranes constructed from lipid bilayer vesicles3,4,5,6,7, polymersomes8,9, or proteinosomes10,11, which can also be used to establish internal compartmentalisation12,13. Inspired by the membrane-less organelles known to sustain various functionalities in living cells14, structures such as polymer coacervates, biomolecular condensates, and hydrogels are gaining traction as versatile and robust alternatives to establish both external and internal compartmentalization in synthetic cells15,16,17,18.
Leveraging the versatile toolkit of DNA nanotechnology19, multiple solutions have been developed to engineer synthetic droplets and condensates from the self-assembly of artificial DNA nanostructures, whose size, shape, functionality, valency, and mutual interactions can be precisely programmed20. DNA droplets or condensates are biocompatible and can act as scaffolds for both synthetic cells and organelles, hosting chemical and biomolecular reactions21, computing information22,23, capturing and releasing cargoes24,25, and sustaining structural responses26.
Among the diverse designs of condensate-forming DNA nanostructures, amphiphilic DNA nanostars - dubbed C-stars - have proven robust and versatile27. C-stars are simple branched motifs consisting of a fixed DNA junction (typically four-way), from which double-stranded (ds)DNA arms emerge28. The arms are then tipped with hydrophobic moieties, typically cholesterol, rendering the nanostructures amphiphilic and driving their condensation following a straightforward one-pot annealing. C-star condensates afford precise structural and functional programmability, including the possibility of establishing multi-compartment architectures29,30, structurally responding to DNA and cation triggers31, synthesizing macromolecules29, capturing and releasing payloads32, and interacting with live cells33. Below, we will describe and discuss protocols to produce C-star condensates starting from their constituent oligonucleotides.
The protocol summarizes the preparation of unary (one-component) and binary (two-component) condensates, utilizing three different C-star designs (Figure 1) -&#34;Non-responsive&#34;, &#34;TMSD-responsive&#34;, and &#34;RNA-templating&#34;. The &#34;Non-responsive&#34; C-star (panel A) consists of four &#34;core strands&#34; with distinct sequences forming the four-way junction. Four identical cholesterol-modified oligonucleotides are connected to the junction, ensuring that a cholesterol molecule is present at the end of each arm. The non-responsive C-stars constitute simple, inert scaffolds for unary and binary condensates. In the &#34;TMSD-responsive&#34; C-star (panel B), the connection between the cholesterolised strands and the junction is ensured by a &#34;Toeholding bridge&#34; strand, which features a dangling single-stranded (ss)DNA &#34;toehold&#34; domain. In the presence of an invader DNA strand with a complementary toehold domain, a toehold-mediated strand displacement reaction can be triggered34, whereby the invader displaces the Toeholding bridge, breaking the connection between the junction and the hydrophobic moieties and triggering the disassembly of the DNA network32. Finally, the &#34;RNA templating&#34; C-star (panel C) includes a &#34;Base&#34; modification complementary to a &#34;Bridge&#34; strand, the latter of which links the transcribable ssDNA template for the Broccoli aptamer29. Sequence details of the constituent oligonucleotides for the three types of C-star designs mentioned here can be found in Supplementary Table 1 and across previous works29,30,32.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66738/66738fig01v2.jpg" /> 
Figure 1. Schematics of three different designs of amphiphilic DNA nanostars (C-stars). Oligonucleotide sequences for various examples of the C-stars described here can be found in Supplementary Table 1. (A) Schematic of a C-star designed to form non-responsive condensates, with the component oligonucleotide strands &#34;Core 1&#34;, &#34;Core 2&#34;, &#34;Core 3&#34;, &#34;Core 4&#34;, (coloured in shades of pink) and &#34;Terminal cholesterol&#34; (coloured in blue). Each unique colour represents an oligonucleotide strand of unique sequence. &#34;Core 1&#34; and &#34;Core 3&#34; are each partially complementary to &#34;Core 2&#34; and &#34;Core 4&#34;, but non-complementary to each other. (B) Schematic of a C-star designed to disassemble upon the addition of an invading strand via&#160;toehold-mediated strand displacement, as described in previous work32. This C-star is composed of &#34;Core&#34; and &#34;Terminal cholesterol&#34; strands (coloured in grey) as well as a &#34;Terminal complement&#34; (shown in orange) and a &#34;Toeholding bridge&#34; strand (shown in dark teal). The latter contains a six-nucleotide overhang to which an appropriately designed invader strand can bind and subsequently entirely displace the &#34;Toeholding bridge&#34; strand, which causes the dissociation of the central nanostar junction (composed of &#34;Core 1, 2, 3, and 4&#34;) from the duplexes composed of the &#34;Terminal complement&#34; and &#34;Terminal cholesterol&#34; strands. (C) Schematic of a C-star functionalised with a DNA template for an RNA aptamer. This, too, is composed of the &#34;Terminal cholesterol&#34; strand and &#34;Core 2, 3, and 4&#34; (all shown in grey), as well as an extended version of the &#34;Core 1&#34; strand (shown in pink), a &#34;Base&#34; strand (brown), a &#34;Bridge&#34; strand (yellow), and the &#34;Aptamer template&#34; (green). The DNA duplex composed of the latter two strands forms the T7 polymerase promoter region, which marks the transcription start site. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66738/66738fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
C-star condensates form upon thermal annealing of the constituent oligonucleotides, which in the protocol presented here is conducted within sealed glass capillaries with a high aspect ratio rectangular cross-section. These containers offer multiple key advantages: i) Sealing ensures that evaporation is completely prevented over the (sometimes slow) annealing steps; ii) The optical-quality flat bottom of the capillaries enables imaging of the self-assembly (or disassembly) transient; iii) the high aspect ratio of the capillaries ensures that heavy condensates settle over a wide, flat area, reducing chances of coalescence and aggregation at later stages of the self-assembly transient that would occur in wedge-shaped containers (e.g., microcentrifuge tubes), and producing relatively monodisperse condensate populations; iv) performing the annealing in an elongated glass capillary minimizes exposure of the sample to hydrophobic interfaces (air, plastic or oil), which have been observed to perturb self-assembly by recruiting the amphiphilic cholesterolised oligonucleotides. Once the assembly protocol is completed, condensates can be extracted from glass capillaries for further experiments that involve additional reagents.

Autor em destaque: Desenvolvimento de células sintéticas a partir de nanoestruturas de DNA anfifílico programáveis

Condensados sintéticos e arquiteturas semelhantes a células de nanoestruturas de DNA anfifílico

Após o recozimento, os condensados de estrela C podem ser visualizados diretamente no tubo capilar ou após a extração, para confirmar sua formação. Para todas as variações de projeto de estrela C, deve-se observar condensados esféricos ou poliédricos distintos com aproximadamente 10-50 μm de diâmetro, este último se formando quando ocorre a cristalização28,32. Para condensados de componente único, os condensados devem ser discretos e uniformes na ...

Apresentamos um protocolo para preparação de condensados biomoleculares sintéticos constituídos por nanoestrelas de DNA anfifílico a partir de seus oligonucleotídeos de DNA constituintes. Os condensados são produzidos a partir de um único componente de nanoestrela ou de dois componentes e são modificados para sustentar a transcrição in vitro de RNA a partir de um molde de DNA incorporado.

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be ...

Nossa pesquisa se concentra no uso de nanoestruturas de DNA anfifílico programáveis para desenvolver células sintéticas que imitam células biológicas. Estamos estudando como e por que nossas nanoestruturas se automontam e como torná-las funcionalmente complexas para aplicações potenciais, como entrega de medicamentos, modelagem de materiais e armazenamento de informações. Em primeiro lugar, nosso protocolo apresenta uma plataforma simples e modular para projetar células sintéticas com complexidade estrutural e funcional.Em seguida, o recozimento de tubos capilares de vidro condensados de DNA oferece uma maneira robusta de produzi-los. E o que realmente gostamos nesse método é que podemos obter imagens dos condensados diretamente sob um microscópio. Ao combinar nossos condensados com outros blocos de construção modulares, mostramos como um processo simples pode ser usado para gerar estruturas complexas sem a necessidade de equipamentos caros ou etapas demoradas de síntese e purificação.Nosso trabalho permite que outros pesquisadores da área construam suas próprias células sintéticas usando nossas nanoestruturas de DNA anfifílico. Esperamos que outros aproveitem um protocolo robusto e simples para projetar estruturas responsivas que possam ajudá-los a resolver suas próprias questões de pesquisa.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures

480 visualizações.  University of Cambridge. Nossa pesquisa se concentra no uso de nanoestruturas de DNA anfifílico programáveis para desenvolver células sintéticas que imitam células biológicas. Estamos estudando como e por que nossas nanoestruturas se automontam e como torná-las funcionalmente complexas para aplicações potenciais, como entrega de medicamentos, modelagem de materiais e armazenamento de informações. Em primeiro lugar, nosso protocolo apresenta uma plataforma simples e modular para projetar células sintética...

Vídeo: Autor em destaque: Desenvolvimento de células sintéticas a partir de nanoestruturas de DNA anfifílico programáveis

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be used to establish compartmentalization and sustain life-like responses. Synthetic DNA nanostructures have demonstrated significant potential as condensate-forming building blocks owing to their programmable shape, chemical functionalization, and self-assembly behavior. We have recently demonstrated that amphiphilic DNA "nanostars", obtained by labeling DNA junctions with hydrophobic moieties, constitute a particularly robust and versatile solution. The resulting amphiphilic DNA condensates can be programmed to display complex, multi-compartment internal architectures, structurally respond to various external stimuli, synthesize macromolecules, capture and release payloads, undergo morphological transformations, and interact with live cells. Here, we demonstrate protocols for preparing amphiphilic DNA condensates starting from constituent DNA oligonucleotides. We will address (i) single-component systems forming uniform condensates, (ii) two-component systems forming core-shell condensates, and (iii) systems in which the condensates are modified to support in vitro transcription of RNA nanostructures.

We present a protocol for preparing synthetic biomolecular condensates consisting of amphiphilic DNA nanostars starting from their constituent DNA oligonucleotides. Condensates are produced from either a single nanostar component or two components and are modified to sustain in vitro transcription of RNA from an embedded DNA template.