Este estudo usa QPCR na mucosa gástrica para detectar rapidamente Helicobacter pylori e sua resistência a antibióticos, oferecendo uma ferramenta diagnóstica rápida e precisa com grande significado clínico para o tratamento dessa infecção. É fundamental garantir padrões de contraste de qualidade para QPCR. Consequentemente, o QPCR IC para detecção de Helicobacter pylori é mantido em critérios específicos, e cada condição deve ser satisfeita simultaneamente.
O desvio precoce invalida o teste que requer nova execução. Precisamos de uma ferramenta de diagnóstico poderosa e abrangente para detectar Helicobacter pylori e resistência a medicamentos. Utilizamos QPCR da mucosa gástrica.
Utilizamos primers específicos para esse fim. Acreditamos que estudos futuros com grupos maiores de pacientes validarão e realizarão todo o potencial do QPCR da mucosa gástrica, melhorando o diagnóstico, monitoramento e tratamento do Helicobacter pylori. Para começar, abra a válvula de pinça de biópsia e mova-a lentamente para a mão dominante.
Quando a cabeça da pinça estiver no campo de visão, abra a aba da pinça e manipule o endoscópio na mucosa gástrica do local de amostragem. Aplique uma leve pressão e feche a pinça de biópsia para pinçar o tecido da mucosa gástrica. Com um alicate, extrair as amostras de tecido e colocá-las no tubo de recolha contendo o líquido de conservação.
Uma vez que todos os locais tenham sido amostrados, aperte a tampa do tubo de amostragem e feche-a para evitar a secagem. Rotule os tubos com um número de identificação exclusivo na parte externa. Envie as amostras coletadas para teste o mais rápido possível, evitando o armazenamento.
Ajuste a temperatura de um banho de metal para 100 graus Celsius com antecedência. Se a amostra estiver congelada, remova-a e deixe-a atingir a temperatura ambiente. Misture bem o lisado para suspender a resina de ácido aminodiacético.
Leve 100 microlitros de lisado para um tubo de centrífuga com um elemento filtrante e adicione a mucosa gástrica. Misture o conteúdo usando oscilação de vórtice. Coloque o tubo da centrífuga no banho de metal a 100 graus Celsius por 10 minutos.
Após o aquecimento, remova o tubo e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Centrifugue a amostra a 9.500 G por cinco a 10 minutos e transfira cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo de centrífuga rotulado esterilizado. Se não prosseguir para a próxima etapa imediatamente, armazene temporariamente a amostra a quatro graus Celsius.
Remova a sonda de primer, a solução enzimática misturada e o tampão de detecção do kit. Derreta todos os componentes no gelo ou a dois a oito graus Celsius. Para misturar as amostras, agite-as suavemente e faça uma breve centrifugação em baixa velocidade.
Misture 12,5 microlitros de tampão de detecção, sete microlitros de sonda de primer e 0,5 microlitros de solução enzimática. Misture o conteúdo no tubo e centrifugue-o brevemente. Dispense 20 microlitros da solução de reação de PCR e adicione cinco microlitros de ácido nucleico em cada poço de reação de PCR.
Insira o tubo de reação no termociclador de PCR fluorescente. Defina os parâmetros do ciclo e execute o programa. Colete sinais de fluorescência a 58 graus Celsius para os marcadores desejados.
Após a reação, salve os dados e analise-os usando um software QPCR específico. Os ensaios de QPCR confirmaram a presença de Helicobacter pylori nas amostras A, B, C e E, enquanto a amostra F foi negativa. A amostra A foi suscetível a ambos os antibióticos.
A amostra B exibiu resistência à claritromicina e à levofloxacina. A amostra C apresentou resistência à claritromicina, mas permanece suscetível à levofloxacino. A amostra E foi resistente à levofloxacina, mas suscetível à claritromicina.
