Questo studio utilizza la QPCR sulla mucosa gastrica per rilevare rapidamente l'Helicobacter pylori e la sua resistenza agli antibiotici, offrendo uno strumento diagnostico rapido e accurato con un grande significato clinico per il trattamento di questa infezione. È fondamentale garantire standard di contrasto di qualità per la QPCR. Di conseguenza, la QPCR IC per la rilevazione dell'Helicobacter pylori si basa su criteri specifici e ogni condizione deve essere soddisfatta contemporaneamente.
La deviazione anticipata invalida il test richiede una nuova esecuzione. Abbiamo bisogno di uno strumento diagnostico potente e completo per rilevare l'Helicobacter pylori e la resistenza ai farmaci. Utilizziamo la mucosa gastrica QPCR.
A questo scopo utilizziamo primer specifici. Riteniamo che studi futuri con gruppi di pazienti più ampi convalideranno e realizzeranno il pieno potenziale della QPCR della mucosa gastrica, migliorando la diagnosi, il monitoraggio e il trattamento dell'Helicobacter pylori. Per iniziare, aprire la valvola di bloccaggio della biopsia e spostarla lentamente verso la mano dominante.
Quando la testa della pinza si trova nel campo visivo, aprire il lembo di serraggio e manipolare l'endoscopio sulla mucosa gastrica del sito di prelievo. Applicare una leggera pressione e chiudere la pinza per biopsia per bloccare il tessuto della mucosa gastrica. Utilizzando una pinza, estrarre i campioni di tessuto e inserirli nella provetta di campionamento contenente il liquido di conservazione.
Una volta che tutti i siti sono stati campionati, serrare il coperchio del tubo di campionamento e sigillarlo per evitare che si secchi. Etichettare i tubi con un numero di identificazione univoco all'esterno. Inviare i campioni raccolti per il test il prima possibile, evitando di conservarli.
Regola in anticipo la temperatura di un bagno di metallo a 100 gradi Celsius. Se il campione è congelato, rimuoverlo e lasciarlo raggiungere la temperatura ambiente. Mescolare accuratamente il lisato per sospendere la resina dell'acido aminodiacetico.
Assumere 100 microlitri di lisato in una provetta da centrifuga con un elemento filtrante e aggiungere la mucosa gastrica. Mescolare il contenuto utilizzando l'oscillazione a vortice. Posizionare la provetta da centrifuga nel bagno di metallo a 100 gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo il riscaldamento, rimuovere il tubo e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Centrifugare il campione a 9,500 G per cinque-10 minuti e trasferire con cura il surnatante in un'altra provetta da centrifuga sterilizzata ed etichettata. Se non si procede immediatamente alla fase successiva, conservare temporaneamente il campione a quattro gradi Celsius.
Rimuovere la sonda di innesco, la soluzione enzimatica mista e il tampone di rilevamento dal kit. Sciogliere tutti i componenti con ghiaccio o a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius. Per miscelare i campioni, agitarli delicatamente ed eseguire una breve centrifugazione a bassa velocità.
Miscelare 12,5 microlitri di tampone di rilevamento, sette microlitri di sonda di primer e 0,5 microlitri di soluzione enzimatica. Mescolare il contenuto nella provetta e centrifugarla brevemente. Erogare 20 microlitri della soluzione di reazione PCR e aggiungere cinque microlitri di acido nucleico in ogni pozzetto di reazione PCR.
Inserire la provetta di reazione nel termociclatore fluorescente per PCR. Impostare i parametri del ciclo ed eseguire il programma. Raccogli i segnali di fluorescenza a 58 gradi Celsius per ottenere i marcatori desiderati.
Dopo la reazione, salvare i dati e analizzarli utilizzando un software QPCR specifico. I test QPCR hanno confermato la presenza di Helicobacter pylori nei campioni A, B, C ed E, mentre il campione F è risultato negativo. Il campione A era suscettibile a entrambi gli antibiotici.
Il campione B ha mostrato resistenza sia alla claritromicina che alla levofloxacina. Il campione C ha mostrato resistenza alla claritromicina, ma rimane suscettibile alla levofloxacina. Il campione E era resistente alla levofloxacina, ma suscettibile alla claritromicina.
