Мутагенеза и анализа генетических мутаций в GC-богатых KISS1 рецепторов Последовательность Выявленные у людей с репродуктивным расстройствам

Резюме

Мутации в kisspeptin рецепторов (KISS1R) связаны с репродуктивные расстройства у больных. Здесь мы опишем, как ввести мутации интереса к GC-богатые последовательности KISS1R, а также использование конструкций KISS1R охарактеризовать путь деградации рецептора иммунопреципитации и иммуноблоттинга

Аннотация

Kisspeptin рецепторов (KISS1R) является G-белком рецептор признан курок полового созревания и регулятором репродуктивной компетенции в зрелом возрасте ^1,2,3. Инактивирующих мутаций в KISS1R идентифицированы у пациентов были связаны с iodiopathic гипогонадотропный гипогонадизм (IHH) ^1,2 и преждевременным половым созреванием ^4. Функциональные исследования этих мутантов имеют решающее значение для понимания механизмов, лежащих в регуляции размножения этим рецептором, а также теми, кто определяет болезнь результаты, которые получаются в результате ненормального сигнализации KISS1R и функции. Тем не менее, высоко GC-богатые последовательности гена KISS1R делает его довольно трудно представить мутации или усиливать ген, кодирующий этот рецептор с помощью ПЦР.

Здесь мы опишем метод введения мутаций интерес в этой весьма GC-богатые последовательности, которые были успешно использованы для создания более десятка KISS1R мутантов в нашей лаборатории. Мы оптимизировали ПЦР условия для облегчения усиления спектр KISS1R мутантов, которые включают замены, делеции или вставки в последовательности KISS1R. Помимо решения ПЦР усилитель, а также небольшой процент ДМСО были особенно полезны для улучшения усиления. Такая оптимизированная процедура может быть полезным для других GC-богатых шаблонов, а также.

Выражение вектора, кодирующего KISS1R это использовалось для характеристики сигнализации и функции этого рецептора для того, чтобы понять, как мутации могут менять KISS1R функции и привести к репродуктивным связанных фенотипов. Соответственно, возможности применения KISS1R мутантов порожденных сайт-направленного мутагенеза можно проиллюстрировать многими исследованиями ^1,4,5,6,7,8. Как, например, получить-функции мутации в KISS1R (Arg386Pro), что связано с преждевременным половым созреванием, как было показано, чтобы продлить реагирования рецептора лиганда стимуляции ^4, а также изменять скорость деградации KISS1R ⁹ . Интересно, что наши исследования показывают, что KISS1R разлагается под протеасомы, в отличие от классического лизосомальных деградации описаны для большинства G-белком рецепторы ^9. В примере, приведенном здесь, деградация KISS1R исследуется в человеческих эмбриональных клеток почки (HEK-293) временно выражения Myc с метками KISS1R (MycKISS1R) и обрабатывают протеасом или лизосомы ингибиторов. Сотовые лизатов являются иммунопреципитации использованием агарозы-сопряженных анти-Myc антител с последующим анализом пятно западной. Обнаружение и количественное определение MycKISS1R на пятна осуществляется с помощью LI-COR Odyssey Инфракрасная система. Такой подход может быть полезным при изучении деградации других белков интерес.

протокол

1. Сайт-направленный мутагенез высоко GC-богатых последовательностей гена KISS1R

1. Шаблон: полная кДНК последовательность человека KISS1R с Myc-теги, слитый с его N-конца. Эта последовательность клонировали в выражении pCS2 + вектор, который совместим с клеточных линий млекопитающих затем используется для трансфекции. Это выражение вектора называются в этом документе pCS2 ⁺ Myc KISS1R.
2. Грунтовка дизайн: грунтовки предназначены для перевозки желаемых мутаций, в соответствии с инструкциями Quikchange сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene). В итоге:
   • Оба (прямого и обратного) праймеров должен содержать желаемые мутации и отжига в той же последовательности на противоположных нитей плазмиды (например, прямого и обратного праймеров дополняют друг друга)
     
   • Грунтовка должна быть от 25 до 45 баз долгой и закончится в один или несколько С или G баз
     
     
   • Представленный мутации (ы) должны быть в середине грунтовки и в окружении ~ 10-15 основы правильной последовательности с обеих сторон
   • Температура плавления (Tm) праймеров должна быть равна или превышает 78 ° C. Используйте следующие формулы для оценки Tm:
     • При внедрении мутаций: Тт = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N -% несоответствия (N является грунтовка длиной в базах)
     • При внедрении вставки или удаления: Тт = 81,5 + 0,41 (% GC) - 675 / N (N не включает в себя основания, которые вставляются или удаляются)
     • Используйте обессоленной праймеров (не далее очищения необходимо).
       
3. Лучшие условия усиления включают добавление PCRx Enhancer решение (Invitrogen) и ДМСО. По крайней мере, 2 концентрации ДМСО, например, 4% и 8%, должны быть проверены. Условия ПЦР приведены в таблице и на рисунке 1, а результаты представителя ПЦР из pCS2 + MycKISS1R показано на рисунке 2.
4. Ликвидация родительской ДНК на усиление продуктов переваривания метилированной ДНК с ДПНИ в течение 1 ч 30 мин при 37 ° С: смешайте в 17.5μl центрифуге трубки продуктов ПЦР с 2μl 10х NEBuffer 4 и 0.5μl ДПНИ (10U; Новой Англии Биолабс).
5. Преобразование ДПНИ обработанных продуктов ПЦР: смешайте 2μl ДПНИ обработанной ДНК с 45μl из XL10-Gold Ultracompetent Е. палочка (Stratagene) в предварительно охлажденные 15 мл трубки культуре клеток. Добавить 2μl из β-меркаптоэтанол и следуйте инструкциям Stratagene. Пластина 100-400μl трансформированных бактерий в LB-агаром содержащие 100μg/ml ампициллин и инкубировать при температуре 37 ° C.
6. Miniprep от 2 до 4 отдельных колоний, чтобы изолировать ДНК плазмиды. Подтверждение успешного внедрения желаемой мутации путем секвенирования и анализа выделенной ДНК.

2. Переходные трансфекции MycKISS1R в НЕК-293 клетки

1. Следующие эксперименты проводятся в человеческих эмбриональных клетках почек (HEK-293) культивировали в инкубаторе CO ₂ (5% CO ₂₎ при 37 ° С в DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина.
2. Семенной НЕК-293 клеток на 2.5x10 ^{5 клеток} / мл в 6-луночных планшетах, и пусть они растут в течение ночи при 37 ° С до трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: (я) используют трех экземплярах скважин для каждой экспериментальной состоянии; (II) идеал слияния клетка во время трансфекции составляет 30% -50%.
3. Трансфекции НЕК-293 ячеек с помощью реагента GenePorter трансфекции (Genlantis), в соответствии с инструкциями производителя: Смешайте половину бессывороточной DMEM с 0.5μg pCS2 + MycKISS1R плюс 0.5μg контроля (пусто) вектор суммировать 1 мкг ДНК / хорошо. Смешайте другая половина с 10 мкл реагента трансфекции на мкг ДНК трансфекции. ПРИМЕЧАНИЕ: Идеально плазмиды концентрация ДНК может меняться.

3. Лечение клеток и лизис

1. 24 часа после трансфекции, замените клеточной среде с 1 мл DMEM, содержащей 2,5% FBS (для уменьшения клеточного метаболизма). ПРИМЕЧАНИЕ: Это снижение в сыворотке может содействовать и / или усилить выявление результатов.
2. Добавить лизосомы ингибитора (100μg / лунку Leupeptin) непосредственно в каждую лунку по одной весь 6-луночный планшет. Инкубировать при 37 ° С в течение 6 или 16 часов (или другую нужную раз)
3. Добавить свежеприготовленный протеасомы ингибитора (10 мкм / лунку MG132), непосредственно во все лунки двух целых 6-луночных планшетах. Инкубировать при 37 ° С в течение 2, 4, 6 или 16 часов (или желаемого раза). Добавить автомобиля во все лунки четвертого 6-луночного планшета (0 временной точке) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 16 ч
4. При инкубации в течение, перемещение пластины в лед и выполнять всю процедуру лизиса на льду для предотвращения деградации белка:
   • Для увеличения выход белка, объединить трем образцам на 6-луночных планшетах в одном Centrifuge трубки
   • Аспирируйте средних и мыть клетки один раз с 1 мл ледяной фосфатным буферным раствором (PBS)
   • Добавить 100 мкл ледяного буфера для лизиса (20 мМ HEPES, рН 7,4, 1% NP-40, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,25% натрия дезоксихолата), содержащий ингибиторы протеазы (1x коктейль содержащих 100mM AEBSF-HCl, 80μM апротинин, 5мм bestatin, 1,5 E-64, 0,5 М ЭДТА, 2 мм и 1 мм leupeptin пепстатина, плюс 2 мМ PMSF) в каждую лунку
   • Удалить ячейки с скребок клеток и передачи клеточных лизатов в центрифужные пробирки
   • Pass клетки ~ 10 раз в течение 20-иглы. ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрушать ультразвуком образцы предназначены для западных обнаружения пятна мембранных белков. Ультразвуком приводит к агрегации мембранных белков, которые не будут мигрировать должным образом во время электрофореза
   • Инкубируйте клеточных лизатов в течение 1 ч при температуре 4 ° С на качалке платформы
   • Центрифуга клеточных лизатов при 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х оборотов в минуту и ​​передачи супернатанты новых труб. ПРИМЕЧАНИЕ: Не беспокоить гранул во время этого шага
   • Определение концентрации белка в 10 мкл супернатантов методом BCA (Pierce)
   • Развести лизатов на 1mg/ml с лизисом буфер, содержащий ингибиторы протеазы.

4. Иммунопреципитация и иммуноблоттинга обнаружения MycKISS1R

1. Выполните следующие шаги иммунопреципитации на льду (или при температуре 4 ° С):
   • Вымойте соответствующее количество агарозном-сопряженных анти-Myc антител (2.5μg / образец) два раза в ледяной PBS и добавить это к 400μg лизата белка.
   • Иммунопреципитации MycKISS1R на лизаты течение ночи при 4 ° С на качалке платформа с мягкой агитации.
   • Спином вниз агарозном бисером импульсным центрифугированием при 4 ° С (до 10000 х оборотов в минуту)
   • Аспирацию и отбросить супернатанты (не нарушая пеллет)
   • Вымойте бисером раз с ледяной буфера для лизиса и дважды с ледяным PBS. Обратить трубы аккуратно перед спиннинг
   • Ressuspend бисером содержащих антиген-антитело MycKISS1R в 2 раза буфером загрузки образца, содержащего 10% β-меркаптоэтанола.
2. Иммуноблоттинга из MycKISS1R иммунных комплексов:
   • Тепло образцов в течение 30 мин при 37 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите образцы предназначены для западных обнаружения пятна мембранных белков. Как ультразвуком, кипячение также приводит к агрегации этих белков
   • Перемещение трубы сразу в лед в течение 5 мин
   • Отдельные белков SDS-PAGE в 4-15% градиент геля.
   • Трансфер в Immobilon-ФЗ PVDF мембраны (для инфракрасного обнаружения) на 25В в течение 30 минут в передаче буфера (48 мм трис базы, 39мм глицин, 1,2 мм SDS, 20% метанола, рН 9,2) с помощью Bio-Rad полусухого Трансфер аппарат
   • Вымойте мембран в течение 5 мин при комнатной температуре с Трис-буферного раствора (TBS) и блокировать в течение 1ч при комнатной температуре с Licor Odyssey блокировка на качалке платформы (в качестве альтернативы, 5% молока в TBS могут быть использованы для блокирования неспецифического связывания).
   • Инкубируйте мембран в течение ночи при 4 ° С с кроличьих анти-Myc антител (1:500) в блокирующем растворе, содержащем 0,1% Твин-20
   • Удаление первичного антитела и мыть мембраны 3 раза из 5 мин каждая с TBS, содержащем 0,1% Твин-20 (TBST)
   • Инкубируйте мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре с козьим Инфра-RedDye ® 800CW меченные анти-IgG кролика (1:10000) в блокирующем буфере, содержащем 0,1% Твин-20 и 0,01% SDS
   • Удалить вторичными антителами, мыть мембраны 3 раза из 5 мин каждая TBST и в последний раз с TBS только (чтобы удалить остатки твин-20)
3. Работа с изображениями и количественная оценка MycKISS1R использовании LI-COR Odyssey инфракрасного тепловизора:
   • MycKISS1R на мембранах будет отображаемого использованием LI-COR Odyssey инфракрасного тепловизора. Во-первых, место мембрану на нижнем левом углу Odyssey сканера, совместив его с сеткой. Крышка с резиновым ковриком, сгладить пузыри с роликом и закройте крышку
   • Создать новый файл проекта на компьютере. Имя файла, нажмите кнопку "Готово", а затем введите сканер Войти на "сканирование". Размер окна сканера консоль под свои мембраны, а затем выберите 169μm разрешении и средним качеством изображения
   • Выберите интенсивности параметров 700 (красный) и 800 (зеленый) каналов в соответствии с ожидаемыми сила каждого сигнала. Это сигнал для целей визуализации только и не будет влиять на количественный. Нажмите кнопку "пуск сканирования"
   • Имя и сохранить результат сканирования, затем нажмите кнопку "OK", чтобы открыть его в новом окне для количественной оценки. MycKISS1R мономеров должна быть видна примерно 43kD
   • Использование "окно" инструмент (на левой боковой панели), нарисуйте прямоугольник вокруг первой группе. Перетащите рамку вокруг, чтобы убедиться, все диапазоны приспособиться, то "копировать" и "вставить" окно по всем зонам
   • Выбрать все ящики с помощью "Ctrl +", а затем выберите опцию вычесть средний фон. Нажмите кнопку "отчет" в верхнем меню и таблицы с количественной величины появятся. Представитель результаты, показанные здесь, represented как раз-увеличение по сравнению с необработанными клетками (нулевое время)

5. Представитель Результаты:

1. Сайт-направленный мутагенез высоко GC-богатых последовательностей гена KISS1R:
   Таблица 1. Показывает, сочетание реагентов для повышения эффективности KISS1R усиления. Эта комбинация успешно использованы для введения нескольких мутаций направлены против различных регионах KISS1R кДНК последовательности, а также для усиления этой весьма GC-богатых гена. На рисунке 1 показана езда на велосипеде и усиления условий для мутагенеза KISS1R. Эти условия были изменены с QuikChange сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene).
   Рисунок 2. Показывает, представитель результате использования этой оптимизированный протокол. Кроме того на 4% или 8% ДМСО в сочетании с PCRx Enhancer значительно повышает выход усиления GC-богатых KISS1R кДНК содержащие плазмиды. В этом представительном эксперимент, 4% ДМСО при условии, чуть лучшие условия усиления по сравнению с 8% ДМСО. Преобразование ДПНИ обработанных продуктов амплификации с ultracompetent Е. палочка обычно дает от 100 до более 1000 колоний, и, насколько успешным будет внедрение желаемых мутаций составляет 80-90%, как это определено секвенирования ДНК.
2. Использование конструкции MycKISS1R для изучения физиологии рецепторов:
   В этом представительном эксперимент, дикого типа pCS2 + MycKISS1R усиливается в соответствии с оптимизированным протокол, описанный здесь, используется для исследования в естественных условиях KISS1 рецепторов деградации в соответствующую строку ячейки (HEK-293) временно выражения MycKISS1R. После обработки трансфицированных НЕК-293 клеток с лизосомы (leupeptin) или протеасом (MG132) ингибиторы в соответствии с протоколом описаны в методах, клетки лизируют и обрабатываются для западных пятно. Верхней панели На рисунке 3 показана проверка MycKISS1R мономеров в то время как нижняя панель показывает количественное полос показаны на верхней панели. Количественное полос показывает, что ни 6ч ни 16h из leupeptin лечения пострадавших уровней MycKISS1R белка. С другой стороны, лечение MG132 в результате зависящих от времени увеличение MycKISS1R белка в этих клетках, который завершается в 45 раз накопление рецепторов после 16 ч инкубации с MG132. Эти наблюдения показывают, что, в отличие от большинства G-белком рецепторы, KISS1R разлагается под протеасом (а не лизосомы).

		ДМСО
Реагенты	0	4%	8%
Воды	35	33	31
10x Pfu Ультра Taq буфер	5	5	5
дНТФ смеси (10 мм)	1	1	1
Грунтовка смысле (25pmol/μl)	1	1	1
Грунтовка антисмысловых (25pmol/μl)	1	1	1
10x PCRx Enhancer решения	5	5	5
ДМСО	0	2	4
Pfu Ультра Taq-полимеразы (2.5U/μl)	1	1	1
ДНК плазмиды (20ng/μl)	1	1	1

Таблица 1. Сочетание реагентов успешно используется для мутировать и усилить GC-богатых KISS1R

Рисунок 1. Велоспорт условий успешного мутагенеза и усиления GC-богатых KISS1R: 2min горячий старт последовал 18 циклов плавления 30 сек при 95 ° С, 1 мин отжига при 55 ° С и 6 мин расширения при 68 ° C. Еще 10 мин расширения при 68 ° C была добавлена ​​в конце последнего цикла. Эти параметры были скорректированы из оригинального протокола мутагенеза QuikChange II XL-сайт-направленного мутагенеза комплект (Stratagene).

Рисунок 2. Визуализация GC-богатых pCS2 + Myc KISS1R усиливается в наличии или отсутствии ДМСО: пять мкл аликвоты pCS2 + Myc KISS1R усиливается в присутствии 0, 4 или 8% ДМСО были погружены в этом представительном 1% агарозном геле, окрашивали этидия метила и визуализируется с помощью УФ света. Плазмиды полос 6Кб видны с обеих полос загружается с продуктами ПЦР усиливается в присутствии 4% и 8% ДМСО, но не на первой полосе, который был загружен ПЦРПродукт усиливаются в отсутствие ДМСО.

Рисунок 3. Влияние leupeptin или MG132 на уровни белка Myc KISS1R в НЕК-293 ячеек: HEK-293 клеток, экспрессирующих Myc KISS1R лечили 100μg/ml leupeptin или 10 мкм MG132 при 37 ° С в течение назначенного времени. Myc KISS1R на 400μg клеточных лизат иммунопреципитации с 2.5μg агарозы-сопряженных анти-Myc антитела и проанализированы иммуноблоттинга. () LI-COR Odyssey обнаружения Myc KISS1R после инкубации иммуноблотов с кроликом анти-Myc-теги антител с последующей инкубацией с IRDye 800CW меченные анти-кролик; (B) Количественная оценка Myc полосы KISS1R показано в (), используя LI-COR Odyssey количественного программного обеспечения. Результаты представлены в виде диван-увеличение по сравнению с необработанными клетками (время 0).

Обсуждение

Сайт-направленный мутагенез был использован для исследования функции белка, вводя изменения в нуклеотидной последовательности, кодирующей целевых генов на протяжении более трех десятилетий. Оригинальная методика была описана в 1978 году англо-канадского химик, лауреат Нобелевской пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
10x PCRx Enhancer решения	Invitrogen	52391
PfuUltra Высококачественное ДНК-полимераза Альтернативные моющих средств	Stratagene	600385
ДПН-I	New England Biolabs	R0176
XL10-Gold Ultracompetent Е. кишечной клетки	Stratagene	200314
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Фетальной телячьей сыворотки	Атланты биологические	S11550
Geneporter Трансфекция реагент	Genlantis	T201007
Leupeptin	Calbiochem	108975
MG132	Calbiochem	47491
10xPBS	Амбион	AM9625
Ингибитор протеазы коктейль и PMSF	Санта-Крус биотехнологии	Sc-24948
Пирс BCA белка Пробирной Kit	Thermo Scientific	23225
анти-Myc теги (клон 4A6) агарозном сопряженных	Millipore	16-219
2x загрузки буфера	BioRad	161-0737
Критерий Трис-HCl сборных гель, 4-15% градиент	BioRad	345-0028
Immobilon-ФЗ PVDF мембраны	Millipore	IPFL00010
Одиссея блокирующего буфера	LI-COR Biosciences	927-40000
10xTBS	BioRad	170-6435
Кролик анти-Myc антител	Сотовые сигнализации	2272
Коза анти-кролик IRDye 800CW	LI-COR Biosciences	926-32211
Одиссея изображений Инфракрасная	LI-COR Biosciences
Остановить ингибитор протеазы коктейль (100x)	Thermo Scientific	78430