Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

Резюме

Настоящая статья описывает шаги, необходимые, чтобы изолировать и охарактеризовать РНК-полимеразы верности вариантов РНК-содержащих вирусов и как использовать данные частоты мутаций, чтобы подтвердить верность изменения в культуре ткани.

Аннотация

РНК-вирусы используют РНК-зависимой РНК-полимеразы, чтобы повторить их геномов. Внутренне высокий уровень ошибок этих ферментов большой вклад в поколение чрезвычайное разнообразие населения, что облегчает адаптацию вируса и эволюции. Появляется все больше данных показывает, что внутренняя процент ошибок, и в результате частоты мутаций, РНК-содержащих вирусов можно модулировать тонкими аминокислот изменения кислоты в вирусной полимеразы. Хотя биохимических анализов существуют для некоторых вирусных РНК-полимеразы, которые позволяют количественная мера включения верности, здесь мы опишем простой метод измерения частоты мутаций РНК-содержащих вирусов, которые оказались столь же точны, как биохимические подходы в определении верности изменения мутаций. Подход использует обычных вирусологических и последовательности методов, которые могут быть выполнены в большинстве лабораторий биологии. Основываясь на нашем опыте с числом различных вирусов, мы определили основные шаги, которые должны быть оптимизированы, чтобы увеличить вероятность выделения верности варианты и накопление данных о статистической значимости. Выделение и характеристика верности изменения мутации может дать новое понимание структуры полимеразы и функции ^1-3. Кроме того, эти верности варианты могут быть полезными инструментами для характеристики механизмов адаптации и эволюции вирусов ^4-7.

протокол

1. Определите диапазоне концентраций мутаген, который минимально токсичны для клеток

Цель этого упражнения состоит в определении, какой диапазон концентраций мутаген может быть использована во время инфекции без избыточной токсичности клетки. По сути, вы хотите, чтобы воспроизвести условия, которые будут необходимы для вирусной инфекции. Для большинства вирусов, инфекций длится от 2 до 7 дней. Подготовка пластин достаточно, чтобы образец клеток на каждый день. Если не соблюдают клетки используются, изменить протокол соответственно.

1. За день до эксперимента, семена 7 х 10 ⁵ HeLa клеток / лунку в 6-луночного планшета, которые достигают к югу от сливной (75%) монослоя день эксперимента. Каждая лунка пластины будут относиться с разной концентрацией мутаген, что позволяет диапазоне от 6 концентрациях.
2. В день эксперимента, подготовить мутаген разведений в культуральной среде. Для клеток HeLa, использование диапазона от 0 до 1000 мкм для базовых аналогов (рибавирин, 5-фторурацил, 5-азацитидин), от 0 до 50 мм для MgCl ₂ и от 0 до 5 мм для MnCl _2.
3. Аспирируйте среды из скважин и заменить 2 мл мутаген-добавляемой средних и вернуться в инкубаторе.
4. Каждые 24 часа, использование одной пластины клеток и проверить жизнеспособность клеток. Это можно сделать, выполнив трипанового синего окрашивания или с использованием коммерческих флуоресценции / люминесценции анализы (CellTiter-Glo например Promega ®, люминесцентные Пробирной жизнеспособности клеток).
5. Для окрашивания трипанового исключения синий, отделить клетки от одной пластины (лечение с различными концентрациями мутаген) и аккуратно гранулах клетки центрифугированием.
6. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в PBS (сыворотка может повлиять на окрашивание).
7. Смешайте 1 объем суспензии клеток в PBS с 1 объем 0,4% трипанового синий, инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре.
8. В hemacytometer, считать жизнеспособным (неокрашенные) и нежизнеспособных (синие витражи) клеток. Рассчитать процент жизнеспособных клеток для каждой концентрации мутаген, в том числе необработанного контроля. Мы считаем, что условия, в результате которых менее 50% гибели клеток от инфекции конечной точки (при максимальной титры достигнута) идеально подходят для изоляции сопротивлением мутагенным.

2. Определить оптимальные нетоксичные концентрации мутаген, что умеренно снижает титр вируса (примерно 0,5-2 журнал сокращения)

Это упражнение служит для определения концентрации мутаген, что будет оказывать сильное селективное давление, без чрезмерной mutagenizing населения. Для РНК мутагенов, мы находим, что это соответствует 10.5-2 журналы снижение титра вируса. При этих концентрациях, каждый ген мутировал, по крайней мере одну-две позиции. Мутаген может помочь в поколение сопротивления мутации, которые затем будут выбраны по проходу. Если слишком много мутаций вводятся (при очень высоких концентрациях мутагенным), мутанты подшипников сопротивления мутации сами будут смертельно мутагенизированных, препятствуя их изоляции.

1. Семенной пластин с ячейками, с использованием тех же условиях, что и шагу 1
2. В день эксперимента, подготовить мутаген разведений в культуральной среде. Используйте те же диапазоне концентраций, как это определено выше, но исключать концентрацию, в результате более 50% гибели клеток. Подготовка достаточно средний, чтобы покрыть каждую лунку в два раза (4 мл на лунку), что позволяет предварительной обработке клеток до заражения, при этом каждый концентрация мутагена.
3. Аспирируйте средних и предварительной обработки клеток с мутагенным путем инкубирования в мутаген-дополнена средой в течение 2 часов. Для большинства типов клеток, это достаточно времени для поглощения мутаген.
4. Удалите среду и заражают вирусом при низкой множественности заражения МВД (0,1 или 0,01) в минимальном объеме (200 мкл для 6-луночных). Выдержите 15-60 минут, чтобы дать вирусу инфицировать клетки. Рок пластины через регулярные промежутки времени для того, чтобы посевной охватывает клеточный монослой.
5. Аспирируйте прививку вируса и мыть два раза с 2 мл PBS, чтобы удалить как можно больше посевной насколько это возможно.
6. Добавить среды с соответствующей концентрацией мутаген в каждую лунку и инкубировать клетки за сумму, эквивалентную 3-6 циклов репликации.
7. Урожай вирус из каждой скважины и определить, противовирусное действие на вирус титр. Это можно сделать стандартными анализа бляшки или предельного разбавления (TCID _50). Примечание: Количественный анализ вируса с помощью методов, которые измеряют только синтез РНК, могут не подходить, потому мутагенные эффекты не могут быть обнаружены. Мутагенизированных геномов содержащие летальные мутации все же может быть обнаружен QRT-PCR, например, но не будет наблюдаться в пробах вирус жизнеспособность.
8. Из рассчитанных титры, определить концентрацию мутаген, который снижает титры вируса (по сравнению с необработанной инфекционного контроля) по 10.5-2 журналы, которые также не очень токсичны для клеток (в идеале, менее 50% токсичность).

3. Выделение и идентификации из мутаген устойчивые варианты

Выполните большие проходы численности населения в оптимальной концентрации мутаген определено выше, а проверить вируса титры через проход серии. В качестве контроля прохождения вируса в ростовой среде без каких-либо мутагенным. В качестве другого контроля для наблюдения за возможное возникновение дефектных вмешательства частиц (DI), выполнить свежей инфекции в отсутствие мутаген на каждом шагу проход (unpassaged контроля).

1. За день до инфекции, семян 25 см ² колбы с 1,5 х 10 ^{6 клеток} HeLa (другие размеры колбы могут использоваться) для получения суб-сливной монослоев на следующий день.
2. В день инфекции, предварительной обработки клетки в течение 2 часов с среде, содержащей оптимальные концентрации каждого мутаген, определены в разделе 2.
3. Удалите среду и заражают клетки с минимальным объемом в МВД 1 или крупных МВД, которое не приводит в дефектных вмешательства (DI) для образования частиц вируса изучается.
4. После 30-60 минут инфекции, аспирации посевной и мыть два раза PBS, затем добавьте свежей среде, дополненной мутаген в соответствующей концентрации.
5. Инкубировать периода времени, определенного в пунктах 1 и 2, что соответствует максимальному титр вируса в этих условиях. Урожай потомства вируса.
6. Титр вируса в каждый проход и повторите три предыдущих шагах.
7. В течение первых нескольких ходов, титр вируса мутаген обработанные образцы должны упасть, соответственно, по сравнению с оригинальной титр вируса и контроля (без лечения и unpassaged) вируса титры. Если вирус титры мутаген пассировали образцы взобраться обратно на том же уровне, необработанного контроля, население вероятно, содержит мутагенные устойчивый вариант. До 20 или 30 мест может потребоваться, хотя мы выделили большинство наших вариантов верности от 5 до 15 пассажей.
8. Как только вирус титры для данного места серия достичь такой же величины, что и необработанной титры контроля, экстракта РНК из всех образцов, в том числе необработанного контроля с тем же номером прохода. РНК добычи комплекты или Trizol добычи могут быть использованы.
9. Выполните RT-PCR с использованием праймеров, которые усиливают или полимеразной репликазы гены вируса интересов. На втором этапе, всего генома (по крайней мере кодирующих участков) должны быть последовательно изучить вопрос сопротивление фенотипы карты других генов вируса, а также. Это особенно важно для базового аналогового мутагенов, таких как рибавирин, который влияет на другие аспекты вируса и клеточной функции. В этом случае вариант может быть устойчивым к одной из этих других противовирусных мероприятий и не будет вариант верности.
10. Purify-ПЦР продуктов с использованием ПЦР комплект очистки и последовательности, чтобы получить мутаген-стойкие населения консенсусной последовательности. Включите фоне контроля для секвенирования ошибки (см. Обсуждение).
11. Использование программного обеспечения выравнивания последовательности и последовательности вируса консенсуса в качестве эталона, выравнивание последовательностей. Определить новые точечные мутации, при этом особое внимание на любые, которые появляются исключительно в мутаген лечение населения в месте, где вирус титры достичь нормального уровня. Если эта мутация не присутствует в более ранних проходов и нет в необработанных контрольных из того же числа проход (с указанием адаптации к ячейке прохождения культуры), то это мутации, скорее всего, ответственны, по крайней мере частично, за сопротивление мутаген. Не полагайтесь на базе называемые последовательности (текстовый вариант последовательности) и выравнивание программного обеспечения в одиночку. Проверьте хроматограмм для меньшинства пики, которые могли быть пропущены выравнивание программного обеспечения. Мутант представляющих 20-30% от общей численности населения будет по-прежнему показывают, как пика, но слишком малы, чтобы быть признанным в качестве 'N' стандартным анализом последовательности.

4. Как только мутация была обнаружена, изолировать или генерировать вариант и подтвердите сопротивление фенотипа до нескольких мутагенов РНК

Далее, вариант представления выявленные мутации изолирован, чтобы подтвердить ее связь с сопротивлением фенотипа. Важно, что мутация, подозреваемые в изменении точности изучается в генетически чистой фона (то есть, не представляет дополнительные мутации в другом месте генома). В лучшем положении, инфекционные кДНК клон существует, который позволил бы поколение запас мутаген-стойкие вариант на сайт направленного мутагенеза на чистую генетического фона. В этом случае, раздел 4 не является необходимым. Однако, если клон кДНК нет, изоляция может быть сделано путем доска очистка вируса, описанных ниже. Более одного раунда доска очистки может потребоваться, чтобы изолировать вариант на чистую, генетический фон.

1. Выделение мутантов мутаген устойчивы бляшкой анализа.
   1. Для изоляции выявленных мутантов, выполнить стандартный анализ доска под агарозы (от 0,5 до 1% окончательный вес / объем) наложения в 6-луночных планшетах. Подготовка серийных разведений вируса, основанный на фондовом титры, чтобы дилutions, которые будут производить от 10 до 50 хорошо разделенных бляшек.
   2. Когда бляшки четко видны (обычно от 2 до 5 дней после заражения, в зависимости от вируса), знак расположения бляшек на пластинах и с помощью пипетки P200 с фильтром наконечника, мягко погрузиться наконечник через наложение агарозном стараясь не выбить и сдвиг позиции наложения (который бы привести к перекрестному загрязнению отдельных бляшек).
   3. Аккуратно поднимите наконечник из наложения и передачи плагин агарозы, содержащиеся в наконечник Эппендорф, содержащий 250 мкл среды и вихря. Не беспокойтесь, если совет, который снимается не содержит агарозы, для многих РНК-содержащих вирусов, средняя доска для многих РНК-содержащих вирусов содержит 10 ⁵ вирусов и достаточное количество будет передано простым прикосновением кончика к поверхности доски.
   4. Выберите до 10 бляшек на курс лечения мутаген. В зависимости от хроматограмм последовательности, который определили мутации, приблизительно оценить, какой процент населения включает в себя нужные мутации. Цель состоит в том, чтобы изолировать три или четыре доски с мутацией. Некоторые из этих мутантов будет также нести дополнительные, нежелательных мутаций, которые в дальнейшем будут определены путем секвенирования.
   5. Извлечение РНК из этих образцов (но откладывать половину образца, чтобы сделать больший запас вирус), а также выполнять RT-PCR, которые позволят секвенирование всего генома. В среднем, РНК-содержащих вирусов будет содержать до двух мутационные различия по отношению к консенсусной последовательности, таким образом, последовательность 3 или 4 доски очищенной вирусов на время, чтобы определить изолировать, содержащую нужные мутации без каких-либо дополнительных мутаций.
   6. После идентификации, делают большие запасы этого вируса для всех вниз по течению исследований с использованием доски очищенного образца, полученного выше, чтобы заразить большую колбу клеток, например, 8x10 ⁶ HeLa клеток в колбе T75 ..
2. Подтвердите чувствительность мутаген / сопротивления предоставляемых определены мутации.
   1. Использование изолированных или вновь созданный клон, и дикий вирус типа управления подготовлена ​​в аналогичных условиях, повторить эксперименты в разделе 2, используя либо полный спектр концентрациях мутагенным, или концентрация, при которой сопротивление мутация была сгенерирована.
   2. Использование нескольких различных РНК мутагенных условиях (рибавирин, 5-фторурацил, 5-азацитидин, повышение Mg ^{2 +,} Mn ^{2 +).} Если полимеразы вариант устойчив к более чем один вид мутаген, то более вероятно, что этот вариант с высокой точностью. Кроме того, не исключено, что сопротивление мутации, специфичные для одного мутагенных состоянии, особенно после некоторых из этих соединений влияет на РНК вирусов посредством ряда механизмов ^8.

5. Проверьте репликацию ставки

С точностью изменяющие мутации чаще всего карты полимеразы, вполне возможно, что та же самая мутация полимеразы будут существенно изменить репликации кинетики и важно, чтобы определить сходства и различия в репликации, которые позволят лучше сравнение различий в частотах мутации осуществляется ниже. Чтобы сделать это, рассмотреть репликацию по крайней мере два взаимодополняющих подходов - тот, который рассматривает производство вирусов и другого, который исследует синтез РНК.

1. Один шаг кинетики роста вируса
   1. За день до эксперимента, семена 6-луночных по мере необходимости, одной пластины в момент времени для тестирования. Рассмотрите возможность использования трех экземплярах скважин для каждого мутанта и дикого типа вируса.
   2. В день эксперимента, удалите среду и заражают скважин с каждого вируса в МВД от 10 до обеспечения того, чтобы каждая клетка является одновременно инфицированы. Инкубируйте 30-60 минут при температуре 37 ° C.
   3. Рок пластин каждые 10 минут, чтобы избежать высыхания клеточный монослой. Удалить вирус и мыть два раза с 2 мл PBS. Важно, чтобы удалить как можно больше посевной насколько это возможно. Замените ростовой среды.
   4. После инфекции в момент = 0, урожай вируса из одной пластины. Вернуться пластин в инкубатор и урожай вирусов через регулярные промежутки времени, которые охватывают один цикл репликации (например, для 3 часов, 5 часов, 7 часов, 9h, 12h, 24h).
   5. Титр вируса, выращенного в каждый момент времени (например, анализ зубной налет, TCID50, ФФУ анализ), а также график кривые роста титра в зависимости от времени.
2. Кинетика синтеза РНК
   Кинетика синтеза РНК можно контролировать с помощью одного из подходов, указанных ниже. Если это возможно, тех же образцах используется для определения один шаг кинетики роста должен быть использован для измерения уровней РНК.
   1. QRT-PCR. Эта процедура дает очень количественные показатели репликации в широком диапазоне от нескольких копий генома> ¹⁰ 10, в зависимости от чувствительности анализа. Дизайн праймеров и зондов, которые охватывают небольшой фрагмент (<200 б.п.) из хорошо сохранились и геномные области.
   2. Северной блот анализ. Хотя меньше, чем количественные QRT-PCR, эта техника позволяет визуальное подтверждение, что репликация результатов в полный рост геномов и что никаких существенных обрыва цепи происходит в результате полимеразной мутации.
   3. Экспрессия гена-репортера. Если клон кДНК выражения гена-репортера (например люциферазы) доступен, то это может быть использована в качестве суррогатной изучить репликативной способности. Тем не менее, рекомбинантный вирус, не должны использоваться для других приложений (таких, как определение частоты мутаций) с селективным давлением, действующие на этот вирус не будет же, в частности, так как эти вирусы имеют тенденцию удалить вставлен ген-репортер.

6. Мера частоты мутаций

Это очень важный шаг в подтверждении, что выявленные мутации полимеразной устойчивости к мутагенным изменяет репликацию верности. Важно отметить, что мутация частот измеряется здесь не частоты мутаций. Для определения ставки, очень тщательные измерения репликации кинетики (количество РНК синтезируются и длина цикла репликации) должны быть учтены дюйма измерения частоты мутаций Однако, до тех пор, как история прохода и репликации кинетики контролируются, обеспечивает воспроизводимость, количественные показатели репликации верности. Мутация частот может быть определена либо в жизнеспособной популяции вируса (доска клоны или ограничения разведения) или в общей численности населения вирусом (вирус или акции супернатант). Для определения частоты мутаций, подготовить запасов вируса от прохождения позже (например, отрывок 2 или за ее пределами). Важно, что вирус населения успел расширить свое генетическое разнообразие ближе к мутации отбор равновесия.

1. Мутация частоты жизнеспособной популяции вируса
   Этот подход, хотя и более трудоемкий, дает информацию о том, как многие мутации присутствуют в среднем генома, который сохраняет репликации компетенции. Следует отметить, однако, что смещение высшего вариантов фитнес произойдет и нижней фитнес, жизнеспособные варианты, которые не просто доска, например, не может быть обнаружена. Как таковая, она также позволяет лучше мер синонимами (DS) и не синонимы (DN) нуклеотидных замен, которые можно использовать для изучения ли положительный отбор действует на население. Однако, поскольку меньше мутаций будет количественно, большее число последовательности будут необходимы для статистического анализа. Этот метод основан на выделении отдельных вирусов либо очистки бляшки или предельного разбавления, как описано выше. В качестве отправной точки, мы рекомендуем изоляции из 48 отдельных "клоны" диких вирусов типа и мутаген-стойкие вариант. Каждый клональной населения изолирована таким образом предполагается осуществлять любые мутации основателя генома представлены. Количество РНК присутствует в изолированных бляшки или предельного разбавления и, как правило, достаточным для амплификации с помощью ПЦР. При необходимости усиления короткие (менее одного цикла репликации) на минимальное количество клеток (например, 24 и формат пластины) может быть использована для получения более РНК, однако, минимальное усиление должно быть выполнено, чтобы избежать накопления новых мутаций. Обратите внимание, что каждый клон и населения в сравнении должны пройти такое же количество циклов репликации.
   1. Изолировать от 24 до 48 клонов вируса очистки бляшки или предельного разбавления.
   2. Извлечение РНК из изолированных популяций клональных
   3. RT-PCR амплификации фрагмента покрытия до 3кб для каждого образца. Лучше всего для покрытия структурного белка регионе, который имеет тенденцию терпеть более жизнеспособным, чем больше мутаций сохраняется регионов неструктурных генов.
   4. Purify продуктов ПЦР, последовательность и выполнить анализ мутаций (раздел 7).
2. Мутация частот от общей численности населения вирусом
   Хотя преимущество этого второго способа является то, что даже низкие варианты фитнес, будут включены в последовательности, что позволяет более широкую картину спектр мутаций. Тем не менее, оно не может быть идеальным для филогенетического анализа, которые предполагают жизнеспособных популяций вируса (например, DN / DS значения) и определение наиболее важных мутаций, так как смертельная изменения (изменены РНК структуры, стоп-кодоны, драматические аминокислот изменения кислоты) не может быть полностью определены и будет сохранен в анализе. Тем не менее, этот метод позволяет исследователю получить наиболее статистически значимые данные, чтобы подтвердить изменение верности, когда есть нехватка в пробирке биохимического анализа. Этот метод основан на ПЦР-амплификации общей РНК вириона, в том числе геномов с низким уровнем физической формы или летальные мутации, которые не будут производить бляшек. Мутация частоты, полученные этим методом, могут быть в 10 раз выше, чем при бляшки или предельного разбавления клонирования.
   1. Извлечение РНК из общей численности населения вириона
   2. RT-PCR амплитудыфинансовом 800 до 1200 нуклеотидных области от части геномной кодирующей последовательностью, что, как известно, терпеть мутаций и генетических отклонений (например, структурные белки). Большие фрагменты не будет вставлять легко в клонирования векторы, такие как TopoTA и будет производить недостаточное количество трансформантов. Хотя более мелкие фрагменты еще лучше, охват геном последовательность может быть слишком мало, чтобы получить статистическую значимость. Фрагмент не менее 800 б.п. позволяет последовательности охвата двух праймеров и является хорошим компромиссом между максимальной последовательности охвата и минимизации затрат последовательности. Мы считаем, что между 70 и 100 последовательностей покрытие 800 нуклеотидных регионе воспроизводимо подтверждает верность изменены из вариантов мы изучали в лаборатории. Обратите внимание, что другой вектор / клонирования методы могут быть использованы с одинаковой эффективностью.
   3. Purify-ПЦР продукта с использованием коммерческого набора или стандартного извлечения ДНК / осадки.
   4. Если ПЦР-ферментов, вы используете не производят свесы, выполнять 10-минутный расширения путем добавления 1 мкМ АТФ и Taq-полимеразы
   5. TopoTA клон следуя инструкциям производителя
   6. Для каждого вируса населения для изучения, выберите 96 колоний, которые, по имеющимся положительным вставки на синий / белый скрининга на XGal покрытием пластин. Изначально, тест наличия вставки для каждого отдельного региона генома быть клонированы, для подтверждения обоснованности синий / белый экранирования плазмиды скрининга размер на агарозном гелях или одной колонии PCR. Использование размер фрагмента и выше условиям, мы достигаем 90% срабатываний
   7. Расти каждой колонии в жидком бульоне в течение ночи в 1 мл LB среды в 96-бактериальной культуры пластин
   8. На следующий день подготовить minipreps в 96-луночного формата.
   9. Последовательность каждая пластина с достаточно праймеров (праймеров для ПЦР, например, или TopoTA m13 грунтовки), чтобы получить максимальный охват клонированных сегменте. Выполнить анализ мутаций (раздел 7).

7. Анализ последовательности

Выполните последовательность анализа с использованием ссылки или консенсусной последовательности для каждой группы населения и соответствующего программного обеспечения выравнивания. Мы рекомендуем Lasergene или Sequencher, которые могут легко определить SNP, по отношению к консенсусу.

1. Выравнивание последовательностей с помощью соответствующего программного обеспечения (например, Lasergene или Sequencher).
2. Отменить бедным последовательности качества (плохой вызова базы, слишком много 'N, или слишком короткие по длине). Определение нуклеотидной диапазон, который покрывается всех последовательностей. С разных регионов генома будет более или менее терпит мутаций, для сравнения причинам важно, что же регионе полностью покрывается за каждый клон последовательности сохранены для последующего анализа. Таким образом, если несколько реакций последовательности выполняются в клон, и одна последовательность не выполняется для данного клона, отказаться от клонов (все последовательности) из анализа.
3. Выявление и подсчет SNPs, которые отличаются от эталонного штамма.
4. Рассчитать частоты мутаций путем деления общего количества выявленных SNPs общее число нуклеотидов последовательности (количество клонов х длина области последовательности). Представляя это число как среднее число мутаций на 10K п последовательно оказывает количество более удобным для пользователей, то оставляя его на нуклеотид. Например, для дикой популяции типа в таблице 1, 55 mutations/121, 978 общая нуклеотидов Х 10 000 = 4,51 мутаций на 10000 нуклеотидов, последовательность.
5. Если же SNP появляется большое количество клонов, настоящего два значения, включить или исключить эти многократные мутации. Как правило, для вируса населения производится из однородной родителя (бляшкой или очистки от инфекционных клон) и пассировать только несколько раз в культуре клеток, положительный выбор не оказывает его последствия достаточно, чтобы вызвать накопление же SNP и мутации Частота значения, измеренные таким образом лучше отражают ошибки частоты полимеразы с минимальными последствиями положительного или очистки выбора.
6. Определение мутации распределения. Сделайте ранжированный список количество клонов в каждой популяции, которые представляют 0, 1, 2, 3, и т.д. .. мутации в области последовательности.
7. Рассчитать вирусных разнообразие населения по сравнению попарно расстояние. С очищены и ручного редактирования последовательности подготовить выравнивания в том числе ссылки регионе. Есть несколько программ, выравнивание доступны: ClustalW / X ( http://www.clustal.org/ ), мышечные ( http://www.drive5.com/muscle/ ), EbioX для пользователей Mac ( http://www. ebioinformatics.org / ebiox / ), и т.д. Убедитесь, что все последовательности имеют одинаковую длину, обрезать, если необходимо. Рекомендуется начала последовательностей кодирования кодон для облегчения задней анализа. Мы предлагаем сохранить все выравнивания в FASTA формате, который легко читать большинство программного обеспечения.
Для выполнения анализа попарно расстояние, рассчитать все возможные парные сравнения между последовательностями принадлежащих к той же популяции. Средняя мутаций найдено в сравнениях может быть рассчитана для обозначения населения неоднородности.
8. Значения для синонимами (DS) и не синонимы (DN) среди населения могут быть легко получены. Мы находим МЕГА программное обеспечение (http://www.megasoftware.net/) полезно и удобно для такого рода анализа.
9. Для получения выбор направления мы даем две возможности, хотя они не являются единственно возможными. 1) Получите соотношение между ДН и DS. Значения выше 1 означает положительный отбор. Значения ниже 1 означает очищение выбора. 2) Использование Datamonkey веб-сервер ( http://www.datamonkey.org/ ). Добавить выравнивания в формате FASTA и анализировать их с модулем SLAC. Это даст вам оценку DN / DS.
10. Выполнить статистический анализ. В зависимости от количества данных, и количество последовательностей, различные тесты могут быть использованы. Некоторые исследования опирались на хи-квадрат тесты от общего числа мутаций по сравнению с общим числом консенсуса нуклеотидов, где все клоны объединены ^9. Другие исследования выполняются Фишера тесты, рассчитанные на количество последовательностей представления мутаций по сравнению с числом последовательностей без мутаций ^10. Если достаточное количество мутационных данных формируется, мы рекомендуем выполнять место тест сумма таких как Манна Уитни У. Для этого, звание количество клонов в каждой вирусной популяции по количеству мутаций присутствует на каждой последовательности РНК. Манна Уитни будет производить проверку на различия в распределении мутаций населения. По этой причине, мы рекомендуем последовательности не менее 800 пар оснований, чтобы увеличить вероятность нахождения клонов с несколькими мутациями. Этот тест является надежным, но требует больших размерах образца. С другой стороны, он не требует такого же размера выборки для двух групп населения сравниваемых (например, образцы из таблицы 1 N ₁ = 148 и N ₂ = 84).

8. Представитель результаты:

Дозозависимое влияние мутаген концентрации на жизнеспособность клеток и вирусов жизнеспособность показано на рисунке 1. В этом примере, мы обнаружили, что вирус проход в 100 AZC мкМ сократилась в Титр вируса от целевых 10.5-2 журнала, но жизнеспособность клеток HeLa была Не негативное воздействие в течение 2 дней, необходимых для вирусной инфекции. Этот пилотный эксперимент привел к выбору 100 мкМ AZC концентрации для последовательного прохождения вируса, чтобы выбрать для сопротивления мутаген. На рисунке 2 показано начальное снижение титра, а затем появление фенотипа сопротивлением мутагенным. В течение первых нескольких проходов в мутаген, как летальные мутации накапливаются, значительное снижение титра вируса происходит. Постепенно, мутаген-стойкие вариант возникает появление совпадает с ее возвращением к вирусу титры не отличается от необработанного контроля. На данном этапе, большой процент населения вирус представляет сопротивление мутации. Последовательность этого вируса населения показывает, аминокислот изменения кислоты (ы) ответственность. После идентификации и изолированных или вновь созданные, мутаген-резистентный вирус может быть менее чувствительны, чем дикий тип РНК различных мутагенов (базовый аналогов различной структуры, например). На рисунке 3 показана РНК мутаген устойчивый вирус Коксаки В3, что титры выше, чем дикого типа в присутствии рибавирина, 5-фторурацил, и 5-азацитидин и высокой MgCl ₂ и MnCl _2. Широкое сопротивление РНК мутагенов является сильным индикатором повышенного репликации верности. Проверка репликации кинетики вариант верности похож на дикого типа вируса поможет в сравнении мутации частотах. Рисунок 4 изображает один шаг кинетики роста варианта с высоким уровнем точности по сравнению с диким типом. Если репликация ставок и окончательного титры не похожи, то должны быть приняты меры, чтобы сравнить вирус населения такого же размера, которые прошли одинаковое количество раундов репликации. Связь между скоростью синтеза РНК и репликация верности не очень хорошо характеризуется, в частности, в естественных условиях. Медленной скорости репликации может привести к снижению частоты мутаций (выше точность), хотя это не абсолютное правило, как показано на рисунке 4. С учетом указанных выше параметров, установленных, мутация частот вариант верности и диких популяций типа можно сравнить с получения генетического подтверждения верности изменены репликации. Рисунок 5 показывает последовательность выравнивание дикого типа и варианта с высоким уровнем точности, с точечные мутации идентифицированы. Мутации подсчитываются, ранжированы в соответствии с числом мутаций на клон (табл. 1), и представлял, как средняя частота мутаций на население, на 10000 нуклеотидов, последовательность, на рисунке 6.

Рисунок 1. Определение оптимальных условий, чтобы выбрать для сопротивления РНК мутаген. Сохранении высокой жизнеспособности клеток с умеренной (1-2 капля войдите титра вируса) клеток HeLa лечились с указанием концентрации рибавирина и инфицированных дикого типа, вирус Коксаки В3 в МВД 0,01. 48 часов после заражения, вирус потомству был собран и титры были определены TCID _50. Процент клеток, сохранившихся лечение в 48 часов, определяется путем окрашивания Трипановый синий, указан ниже оси абсцисс. Результаты показывают, что концентрации 100 и 200 мкМ снижение титра вируса на 1-2 журнала, не влияя на жизнеспособность клеток.

Рисунок 2. Последовательный проход в наличии умеренной концентрации РНК мутагенов выбирает для мутаген устойчивые популяции. На этом рисунке Чикунгунья Вирус пассировать в клетках HeLa в присутствии 50 мкМ рибавирином (серые столбики). Управление проходы были проведены в отсутствие рибавирином (черные полосы). После каждого прохода, вирус потомству было количественно с помощью классического анализа доска на клетках ВНК. Мутагенное воздействие очевидно во время первого прохода (P1 и P2 по сравнению с р0 начиная населения), где лечение вируса титры сократится на 2 журнала. Постепенно, титры вернуться к нормальной (без лечения) уровней. Никаких существенных различия наблюдаются при прохождении 5 мутаген лечение населения по сравнению с необработанными, предполагая, что резистентные варианты были выбраны. Действительно, консенсус последовательности населения, выявленные уникальные мутации вируса население переживает рибавирином лечения.

Рисунок 3. Подтверждение широкой устойчивостью к РНК мутагенов различной конструкции. Показано здесь, с высокой точностью A372V вариант вирус Коксаки В3, который первоначально был выделен в экран, описанный в разделе 3, был создан один из инфекционного клона и проверены на его относительную чувствительность к различным концентрациям РНК различных мутагенов (рибавирин, 5-фторурацил, 5-азацитидин). HeLa клетки обрабатывали указанных концентраций рибавирина и инфицированных дикого типа, вирус Коксаки В3 в МВД 0,01. 48 часов после заражения, вирус потомству был собран и титры были определены TCID _50. Здесь показаны титры дикого типа (сплошные линии) и A372V вариант (пунктирные линии) в зависимости от концентрации мутаген. A372V последовательно титры выше, чем дикого типа при всех условиях тестирования.

Рисунок 4. Репликация ставки и верности вариантов. Чтобы определить один шаг кинетики роста производства вируса, HeLa клетки были инфицированы в МВД = 10 либо дикого типа (сплошная линия), с высокой точностью вариант A372V (длинное тире) или репликации дефицитный вариант Cx64 (короткий тире) на вирус Коксаки В3. В моменты времени указывалось, вирус потомству был собран из клеток и супернатантах путем замораживания-оттаивания и оттитрованы по TCID _50. Повышение верности A372V не совпадает с наблюдаемым дефектом репликации в культуре ткани. Cx64 вариант представляет собой значительную задержку в репликации кинетики и достигает максимальной титры, которые в 1000 раз ниже, чем дикий тип вируса.

Рисунок 5. Выравнивание TopoTA клонированы последовательности друг от вирусной популяции. Использование подхода, описанного в разделе 7, каждая последовательность, полученная из клонированных ПЦР-продукт предположительно происходит от одного, уникального генома в пределах общей численности населения вирусом и, таким образом, выполнять уникальные мутации. На рисунке показан типичный выравнивание, после очистки бедных последовательности качества и визуализации SNP. Общая ОНП (10 на этом рисунке) в пределах населения подсчитываются, и число SNPs появляться на каждый клон отмечены. Например, клон подчеркивается бар, содержит 2 уникальные мутации в то время как 8 других клонов содержат одно, уникальные мутации. Эти данные используются для компиляции таблице 1. Для просмотра увеличения этой цифры пожалуйста, нажмите здесь .

Рисунок 6. Графическое представление мутации вируса частот населения. Для облегчения интерпретации, численные данные, полученные из последовательности и статистического анализа могут быть представлены либо как диаграммы или гистограммы (см. здесь). A372V вирус генерирует меньше мутаций, чем дикий тип и представляет значительно ниже частоты мутаций (*, р <0,01). Cx64 вариант, что репликация на титры в 1000 раз ниже, чем дикий тип, давлениеродители же частоту мутаций (нс, не имеет значения) о том, что скорость репликации и верности не обязательно связаны между собой. Чикунгунья же вируса (CHIKV) население дает аналогичные частоты мутации вируса ли акции, или 10 ^{5-кратного} разбавления, используется для экстракции РНК.

Мутация распределение резюме для статистического анализа.

Примечание: Для каждого клона, очень важно, что же регионе генома (и длина последовательности) покрывается. В этом случае, 859 нуклеотидов в клоне. Это очень важно для статистического анализа. С другой стороны, суммы рангов тестов, используемых для статистического анализа не требуется размер выборки, чтобы быть таким же, исследователь имеет право сравнивать населения различного размера выборки. Таким образом, 142 клонов дикого типа можно сравнить с 84 клонов A372V.

# Клонов с мутациями н	дикого типа	A372V
7 мутаций	0	0
6 мутаций	0	0
5 мутаций	0	0
4 мутации	0	0
3 мутации	1	0
2 мутации	6	2
1 мутации	40	14
0 мутации	95	68
Всего мутации	55	18
Всего клонов последовательных	142	84
Всего нуклеотидов последовательности	121978	72156
Mutations/10 4 п	4,51	2,49

Таблица 1. . Мутация распределение резюме для статистического анализа Примечание: Для каждого клона, очень важно, чтобы то же генома (и длина последовательности) покрывается. В этом случае, 859 нуклеотидов в клоне. Это очень важно для статистического анализа. С другой стороны, суммы рангов тестов, используемых для статистического анализа не требуется размер выборки, чтобы быть таким же, исследователь имеет право сравнивать населения различного размера выборки. Таким образом, 142 клонов дикого типа можно сравнить с 84 клонов A372V.

Обсуждение

Выбор клеточной линии. Эффективность базы аналогов как РНК мутагенов коррелирует с их относительным поглощения различных типов клеток ^11. Если клеточной линии, которая обычно используется для прохождения вирус оказывается рефрактерным к мутагенным забор или слишком чувствительные (высокая токсичность ячейки), это может быть необходимо использовать другой клеточной линии, которая отвечает этим требованиям, и до сих пор разрешительной к репликации вируса. Как только вариант мутаген сопротивление изоляции, остальная часть характеристики могут быть выполнены в оригинальном, привилегированные клеточной линии. По нашему опыту, HeLa клетки легко занять мутаген; ВНК клетки требуют до 10 раз выше концентрации и Веро клетки поддаются поглощение мутаген.

Выбор мутаген. Пытаясь изолировать верности варианты по мутаген лечение, вероятность успеха возрастает, если больше чем один тип мутаген используется. База аналоговых мутагенов различной структуры, которые ошибочно включены в геномах во время репликации будет преимущественно вызывают привести определенное подмножество мутаций в последующих циклах репликации: рибавирин лечения способствует GtoA и CtoU переход мутации ^12; 5-азацитидин имеет подобную предвзятость, с Добавление CtoG и GtoC трансверсии ^13; 5-фторурацил преимущественно вызывает AtoG и UtoC переходов ^14. Кроме того, более высокие концентрации Mg ^{2 +} или Mn ^{2 +} может быть дополнена до среды для повышения общей частоты мутации РНК-содержащих вирусов без смещения описанным выше ^12. В зависимости от кодона вируса последовательности и кодон изменения, необходимые для создания варианта верности, некоторые из этих условий будет способствовать появление этого варианта по сравнению с другими. Для повышения верности воспроизведения полиовируса G64S и вирус Коксаки A372V, рибавирин лечения наиболее легко выбраны для варианта, поскольку необходимый переход AtoG на сайте кодон соответствует мутации преимущественно, порожденная этим рибавирином.

МВД против численности населения. В вирусологии, протоколы для тканей инфекции культуры обратить особое внимание на множественности заражения (МВД), чтобы избежать накопления дефектных вмешательства частиц (низкая МВД) или способствовать рекомбинации между вирусами (высокая МВД), для пример. Чтобы выбрать для появления события через последовательные пассажи, это также важно учитывать размер вирусной популяции. Так как устойчивые мутанты изначально существует на низких частотах, то лучше всего перевести как большой численностью населения, как можно дальше от одного прохода к другому (10 ⁵ -10 ⁶ вирусов, например), чтобы не потерять эти новые варианты на каждом проходе. Расширение размера хорошо или колбе (количество клеток, инфицированных), могут помочь свести к минимуму увеличение МВД, если это вызывает озабоченность. С другой стороны, для экспериментов, в которых чувствительность вируса к мутагенным проходит испытания, низкий уровень инфицирования МВД проводится с целью увеличения числа циклов репликации, происходящих в эксперименте и, чтобы избежать спасения мутагенизированных геномы более высокими геномов фитнес через дополнения в сотрудничестве инфицированных клеток. Это важно, так как мутации, образующихся на потомство геномов во время первого раунда репликации не будет немедленно обнаружена. Большинство из этих мутагенизированных РНК-прежнему будет упакован в вириона. Именно в следующий раунд инфекция, летальные мутации, присутствующие в этих геномах приведет прерван цикл репликации и снижение титра вируса. Это может быть необходимо, чтобы в течение нескольких раундов накопление мутаций до существенного влияния смертельной мутагенеза не наблюдается. Наконец, если в течение прохождения серии в присутствии мутаген, вирус титров продолжать падать до исчезновения, то исследователь должен попытаться пассажей вируса в постепенно увеличивая количество мутаген (начиная с очень низкой концентрации).

Выделение и поколение РНК мутаген устойчивы клона из РНК мутаген устойчивые популяции. РНК мутагенов ввести несколько случайных мутаций в геноме каждого, но отбор на устойчивость только обогатит (и исправить, чтобы консенсус последовательность) Сопротивление мутации. Для выявления этой мутации, мы последовательности населения мутаген устойчивостью (консенсус населения), а не отдельные вирусы. Таким образом, один, случайные мутации созданные мутаген не обнаруживаются в последовательности, и только мутации, которые приводят к консенсусу изменений после отбора, можно найти. По нашему опыту мы только определить одну или две такие изменения последовательности консенсуса. Как только население мутаген устойчивы получается и сопротивления мутации идентифицированы, необходимо сформировать более чистый запас этот вариант. Выше мы описали процедуру доска очистки. Кроме того, если вирус интереса не вызывает легко идентифицировать бляшки, желаемый вариант может быть purifСВУ путем ограничения разбавления. Такой подход существенно TCID ₅₀ в 96-луночного формата, где вирус фондовом разбавляют так, что менее 50% скважин инфицированы. Используя этот разбавления, тот же подход, что и выше будет принято, в изоляции до 10 индивидуальных вариантов и подтверждающие их последовательности. Как уже упоминалось, в лучшем случае, инфекционные кДНК клона штамма вируса доступно. Выделение вариант, таким образом, не требуется. По нашему опыту, верность варианты являются результатом одного аминокислотных замен и тем самым могут быть получены с помощью простых, коммерческий комплекты мутагенеза, таких как Quikchange (Agilent). Вторичных вариант заключается в использовании кДНК клона тесно связаны напряжения. Однако, если Родственный штамм используется, мы настоятельно рекомендуем использовать и этот подход и выделение вируса (например, очистка налета), потому что мы обнаружили, что же верность изменения мутации на двух близкородственных вирусов не обязательно будут иметь тот же эффект.

Верность и репликации. Выбор РНК мутаген устойчивые варианты привели к изоляции обоих высших и низших варианты верности с ростом характеристик, которые похожи на своих диких коллегами типа ^4,12,15. В настоящее время связь между полимеразной активности ставки и верности до конца не изучен. В пробирке биохимических исследований с использованием очищенной РНК-полимеразы, показали, что более высокая точность варианты имеют более медленными темпами обработки, в то время как нижняя верности варианты имеют тенденцию к более быстрой обработки ^1-3,12. В культуре тканей, эти различия не всегда очевидно, предполагая, что наличие ресурсов, а не внутренние кинетики активности полимеразы, является ограничение скорости шага. Если вариант с точностью повторяет кинетику, которые существенно не отличается от дикого типа, то сравнение их частоты мутаций могут быть непосредственно сделаны. Если очень значительные изменения в репликации кинетики существует, то данные должны быть нормализованы для учета кинетической различия, например, сравнение вирусов, которые прошли одинаковое количество циклов репликации. По нашему опыту, хотя никаких существенных различий в один шаг кинетики роста наблюдались между дикого типа и высокий варианты верности, мы обнаружили, что более высокая точность вариантов последовательно титр выше (в течение 1 журнал) по сравнению с диким типом, но они делают немного меньше, РНК (в пределах же порядка), далее предположить, что геномы они производят, содержат меньше мутаций и, таким образом, более заразными.

Подготовка проб и последовательности. Для всех шагов в этих протоколах, крайне важно, чтобы высококачественные, корректура ферменты используются для ПЦР и ОТ-ПЦР для ограничения введения дополнительных мутаций, так как они не могут быть выделены из биологически соответствующих мутаций. Очень важно, чтобы вирус населения для сравнения, были подготовлены в тех же условиях (пассирования, средний культуре ткани, температуры, выделения РНК методом ПЦР-протоколов и т.д.) Кроме того, важно обеспечить, чтобы достаточно исходного материала был получены от добычи РНК, что сильная группа порождена RT-PCR. 1 / 100 разрежение пробы РНК должны также дать обнаружить RT-PCR группы, указывая, что образец содержит достаточное количество молекул РНК, чтобы избежать представления смещения (усиливающих же генома неоднократно). Так как мутации частота распределения, можно было бы ожидать, что аналогичные значения будут получены, независимо от численности населения, при условии, вышеупомянутые смещения не происходит. Как показывает рисунок 6, 10 ^{5-кратным} разведением вируса фондовом дает частоты мутаций, что существенно не отличается от родительских запасов.

До оптимальных условий для TopoTA клонирования будут найдены, подтвердили наличие вставки после синий / белый скрининга, по колонии PCR до секвенирования. В качестве контроля за мутационные шума (мутации введен RT-PCR и секвенирования), клонирование ПЦР-продукт от плазмиды с тем же вирусных последовательностей и / или клон и последовательность ПЦР-продуктов в пробирке транскрипции РНК соответствующего генома вируса (быть Знайте, что различные ферменты в пробирке транскрипции имеют разные количества ошибок и не может дать полезную информацию о том, настоящая ошибка фон в вашей процедуре). Некоторые вирусы последовательности могут быть токсичными для бактерий, поэтому важно, чтобы убедиться в этом до принятия решения по области вирусного генома, чтобы быть упорядочены для частоты мутаций. При анализе последовательностей, полученных от TopoTA, обратите внимание, что каждый клон должен содержать только один вставки / последовательности. Если двойной пик наблюдается, что свидетельствует смешанным населением, вполне возможно, что два соседних колоний бактерий были отобраны. Возможно также, хотя и очень маловероятно, учитывая низкие частоты мутаций в бактериальных репликации, что мутация была введена в усилении плазмиды в бактериальной культуры. В доску рurified населения, двойной пик может представлять перекрытия бляшки, или вирус, который приобретает новые мутации или возврат мутации в доску развития. Будьте последовательны и решение о том, считать или не считать этих мутаций.

Наконец, имейте в виду, что мутация частоты, используемые здесь, являются относительными значениями. Они действительны только при сравнении популяций вируса, выращенного в том же состоянии, и секвенированы за тот же регионе! Они не должны восприниматься как абсолютные значения частоты мутаций, или частоты мутаций генома в целом. Однако, когда условия находятся под контролем, они разрешение воспроизводимым, количественные сравнения различий в распределении мутаций и частоты.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
рибавирин	Сигма	R9644-10 мг
5-фторурацил	Сигма	F6627-1G
5-азацитидин	Сигма	A2385-100мг
MgCl 2	Сигма	M1028-100мл
MnCl 2	Сигма	M1787
Трипановый синий	Сигма	T8154-20 мл
TopoTA клонирования комплект	Invitrogen	10351021
Quikchange мутагенеза комплект	Agilent	200516	Если кДНК клона инфекционного доступно
96-луночного miniprep комплект	Macherey-Nagel	740625
Lasergene, Sequencher	DNAstar, ген кодирует корпорации	www.dnastar.com www.genecodes.com	Или другое программное обеспечение выравнивания