Рассматривая роль носоглотки связанных лимфоретикулярных тканей (NALT) в мышь Ответы на вакцины

Резюме

Методы изучения вклада носоглотки связанных лимфоретикулярной ткани (NALT) для носа и системные иммунные реакции мышей на интраназальных вакцин описаны. Мы показываем, хирургической процедуры, чтобы установить NALT зависит от модели мыши и Бывший естественных условиях Культур извлеченных NALT.

Аннотация

Носоглотки связанных лимфоретикулярной ткани (NALT) у людей, грызунов и других млекопитающих, способствуют иммунитета в носовых пазух ^1-3. NALT два параллельных колоколообразной структур, расположенных в носовые проходы над твердого неба, и, как правило, считаются вторичными компонентами слизистой-лимфоидной системы ^4-6. Расположенный в NALT дискретные отсеков и Т-лимфоциты перемежаются с антиген-представляющих дендритных клеток ^4,7,8. Эти клетки окружены слоем клеток эпителиального интеркалированного М-клетки, которые отвечают за антиген поиск от поверхности слизистой оболочки дыхательных путей ^9,10. Наивные лимфоцитов циркулирующей через NALT готовы ответить на первые встречи с возбудителей инфекций дыхательных путей ^7. Хотя NALT исчезают люди в возрасте до двух лет, кольца и в аналогично построенных Вальдейерова в органах лимфатической продолжают сохраняться йroughout жизни ^6. В отличие от людей, мышей сохранить NALT на протяжении всей жизни, обеспечивая удобную модель животного для изучения иммунных реакций, происходящих в придаточные пазухи носа ^11.

Культур одноклеточных суспензий NALT не практично из-за низкой урожайности мононуклеаров. Тем не менее, NALT биологии можно рассматривать экс культивирование естественных условиях интактного органа, и у этого метода есть дополнительное преимущество поддержания естественной структуры тканей. Ведь в естественных условиях исследования, генетические модели нокаутом представления дефектов ограничивается NALT в настоящее время отсутствуют в связи с плохим пониманием путь ее развития. Например, в то время как лимфотоксина-α мышей атрофировались NALT, патчи Пейера, периферические лимфатические узлы, фолликулярные дендритные клетки и других лимфоидных тканей также изменены в этих генетически модифицированных мышей ^12,13. В качестве альтернативы мышам ген нокаутом, хирургическое удаление рermanently исключает NALT из носовой ход, не затрагивая другие ткани. В результате мышь модель была использована для установления связей между NALT и иммунные реакции на вакцины ^1,3. Последовательный сбор сыворотки, слюна, носовые моет и вагинальных выделений необходимо для создания основы принимающих ответ на вакцинацию, в то время как иммунный ответ, происходящих непосредственно из NALT может быть подтверждено культуре ткани. Следующие процедуры наметить операции, культуры тканей и отбора образцов необходимо изучить местные и системные гуморальный иммунный ответ на интраназально (IN) вакцинации.

протокол

1. NALT сбора и культивирования

1. Усыпить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT. Передача мышей асептических рабочей области или биобезопасности кабинета. Снимите нижнюю челюсть мышью и очистить верхнюю часть неба со спиртом и йодом салфетки.
2. Используйте № 11 хирургические лезвия в хирургической ручкой ножа аккуратно вырезать и акцизов верхнего неба, следуя внутри контура мышь резцы и коренные зубы.
3. Аккуратно отогните неба пинцетом, стараясь не порвать пасть.
4. Этот шаг необходим для снижения загрязнения культур и предназначен для обработки нескольких вкус. Место неба в отдельных скважинах в первом столбце стерильных 48-луночного планшета предварительно заполнены 250 мкл полной культуральной среде (37 ° C), состоящей из RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг / мл стрептомицина, 100 UI / мл пенициллина, 50 мкг / мл гентамицинаи 1 мкг / мл Fungizone / амфотерицин. СМИ должны быть буфером, если карбонат неба культивируют в 5% CO _2/95% влажного воздуха инкубатор (37 ° C), или же использовать 10 мМ HEPES рН 7,4, для не-CO ₂ культуру.
5. Для мытья вкус, используйте щипцы для перемещения неба в каждом последующем также в ряд, аккуратно нажав пластину между мойками, до неба прошел в общей сложности восемь стирок.
6. Передача неба в новую стерильную 48-луночного планшета, содержащие 250 мкл свежей, полной культуральной среде (37 ° C) в скважинах.
7. Поместите чашки, содержащие неба в 37 ° C инкубатор для культивирования в течение всего срока обучения.
8. Сбор образцов для анализа асептической передачи 100 мкл среды от культуры скважин в Эппендорф трубы каждые 24 часа, заменяя 100 мкл свежей 37 ° С культуральной среды.
9. Центрифуга культуры образцы печатных носителей на 380 мкг в течение 10 минут, 4 ° C, для мусора гранулу.
10. Перенести супернатант центрифугируют от образца к свежим труб Eppendorf и хранить при температуре -20 ° C до готовности анализа.
11. Антиген-специфические IgG, IgM, IgA и, или выделяются цитокины измеряется в ткани культуральной жидкости по стандартной иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Хирургическое Удаление NALT

1. Женский BALB / с мышами, от 7 до 9-недельного возраста, пригодные предметы, но и другие штаммы также являются приемлемыми. Обеспечить гелеобразной влажный корм за три дня до операции, чтобы акклиматизироваться мыши к пище и воде замену, которая будет проводиться после операции.
2. Администрирование одна капля Metacam боли препаратов (1,5 мг / мл или 0,05 мг / вывода) в полости рта до операции.
3. Обезболить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства, например, кетамин, acepromazine и ксилазина смеси (KAX) и применить мазь Puralube ветеринара на глаза для предотвращения высыхания. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT.nesthesia может быть подтверждено отсутствие рефлекса ответ на нежный защемления пальцев ног.
4. Администрирование 1 мл физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида инъекций USP) подкожно между лопатками использованием 22-28 иглой и шприцем для предотвращения потенциальных обезвоживания мыши после операции. Кроме того, управление 0,1 мл подкожно Respiram между лопатками использованием 22-28 иглой и шприцем по пропаганде здорового дыхания во время и после операции.
5. Обеспечить тепловой поддержки мыши в течение всех последующих манипуляций.
6. Положите под наркозом мыши в горизонтальном положении, а также использовать два отдельных петель хирургического шва вокруг верхних и нижних резцов мягко взломать рот, обнажая верхнее небо.
7. Используйте № 11 хирургические лезвия, чтобы сделать разрез приблизительно 3 мм в длину вдоль средней линии верхнего неба в месте NALT.
8. Вставьте 0,5 мм microcurette в разрез и аккуратно соскоблить по краямнарушить NALT.
9. Прижечь разрез, чтобы остановить кровотечение с прямой тонкой петлей на тепловую единицу прижигания.
10. Продолжить поддержку в то время как тепловые мышь возвращается в полном сознании и деятельности.
11. Обеспечить мыши подкожно физиологический раствор до трех раз в день, 1 мл на инъекцию между лопатками, чтобы предотвратить обезвоживание при необходимости и устные обезболивающие один раз в день в течение 3 дней после операции. Определить обезвоживание, выполнив тест кожи палатки для проверки тургор кожи. Возьмитесь за кожей и мехом между плечами лопасти так, чтобы она палаточный вверх. Если кожа быстро возвращается к нормальному, предыдущее положение, мышь не обезвожен. Если кожа остается повышенным, и движется медленно, мышь находится в состоянии обезвоживания и требует физиологического раствора. Обеспечить влажные корма, по крайней мере три дня после операции, чтобы обеспечить достаточное время для восстановления.
12. До любой экспериментальной процедуры, соблюдать мышей в течение 8-10 дней, отслеживая веса. Плохо восстановления весаобычно указывает на неполное заживление неба, и эти мыши должны быть выведены из дальнейших исследований.

3. Подготовка NALT для гистологии и оценки успешности хирургии NALT

1. Успех NALT операции должны быть установлены по гистологии, как описано ниже. После завершения всех экспериментальных исследований, подготовки мышей черепной коллекций эвтаназии с использованием утвержденных IACUC руководства. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT.
2. Возьмитесь за затылок из эвтаназии мыши. Снимите нижнюю челюсть от остальной части черепа на Ножницы по мыщелкового процессов с ножницами с обеих сторон.
3. Начиная с затылка, снять кожу и мех с черепом на медленно слезать и резать на вентральной стороне черепа.
4. Осторожно снимите кожу вокруг носовой области и отрезать кожу от кончика морды до полностью удалить.
5. Снимите черепа с позвонками остроумиега надрез на ножницы.
6. Вставить ножницы в большое затылочное отверстие и сократить наполовину черепа по средней линии, чтобы проникновения формалина в мягкие ткани во время фиксации.
7. Исправить черепа в 10% нейтральном буферном растворе формалина (НБФ) в течение 24 часов при комнатной температуре.
8. Чтобы удалить известковые отложения, поместить образец и отдельные кассеты, завернутый в марлю, чтобы предотвратить Rexyn от прикосновения к кости, в бутылке с муравьиной кислотой смеси. Выдержите в течение 12 часов при комнатной температуре, затем смойте непрерывно в проточной воде в течение примерно 20 минут.
9. Обрежьте образца перегородки и прошлое орбиты глаз бритвой.
10. Примеры и кассеты могут быть сохранены для краткосрочных на 10% НБФ.
11. Поместите образец на ткань на ночь процессор обработки. Это делается для удаления воды из образца в рамках подготовки к парафин вложения.
12. Удалить обработанные ткани, использования на парафиновых блоков с мордой вниз, и дайте ему остыть.
13. Обрежьте тух 15 мкм сечения блока с автоматизированной микротома, приближаясь к приблизительное местоположение NALT, а затем продолжить резки в разделах 5 мкм для монтажа на стеклах в 44.3 ° C на водяной бане.
14. Гематоксилином и эозином (H & E) гистологической окраски должны быть использованы для оценки NALT абляции.

4. Сбор биологических образцов от мышей

4,1 сыворотки

1. Тщательно подъемные температуры тела с тепловой лампой увеличится приток крови. Сбор крови уменьшение поперечного сечения боковой хвостовую вену с помощью хирургического ножа. Позвольте крови капать свободно в Microtainer сыворотки трубы сепаратор.
2. Применить мягкое давление на ник с абсорбирующим материалом, таким как марлю или полотенце, чтобы остановить поток крови.
3. Дайте крови свернуться в Microtainers в течение 30 минут, затем центрифуги между 6-15 х 1000 г, по крайней мере 90 секунд.
4. Передача отделить сыворотку от Microtainer в чистую пробирку Eppendorf дляхранение при температуре -80 ° C.

4,2 Слюна

1. Держите под наркозом мыши вертикально, а пипетки 20-30 мкл стерильного фосфатного буфера (PBS) между щекой и десной. Соберите разбавленной слюной, направляя пипетки между щекой и десной.
2. Передача разбавленной слюной в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C.

4,3 носа

1. Эвтаназии мышь перед сбором носа, с использованием утвержденных руководством IACUC. Избегайте использования ингаляционных анестетиков, которые могут повлиять NALT.
2. Проведение мыши вертикально, аккуратно пипеткой 30 мкл стерильной PBS в одну ноздрю и собирать полоскание из другой ноздри.
3. Передача промыть в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C.

4,4 влагалищных выделениях

1. Вставьте кончик пипетки в открытии йэлектронной вульву эвтаназии мыши, промыть влагалище с 50 мкл стерильной PBS и собрать все жидкости микропипетки.
2. Передача промыть в новую пробирку, содержащую 10 мкл 2x ингибитор протеазы и хранить при температуре -20 ° C.

5. Антиген-специфические антитела или цитокинов в собранных образцах могут быть измерены с помощью ИФА или иной количественный метод.

6. Представитель Результаты

На рисунке 1 представлена ​​общая схема действия, связанные с обработкой NALT содержащие ткани для бывших анализ естественных условиях. На рисунке 2 (А, В), размер неба показано, а также место разреза во время операции удаления (А), как показано пунктирной линией. Расположение NALT указаны стрелками в области премоляра на вырезали окрашенных гематоксилином неба на рисунке 2 (C), с указанием параллельно тканей.

Рисунок 3представлены этапы NALT хирургии нарушений, показывая воздействие на верхнее небо для доступа к NALT (A, B), удаления (С), и окончательный прижигание разреза (D). Типичный H & E сечение носовой области синуса окружающих NALT до операции показана на рисунке 3E, а образ NALT срыва microcurette непосредственно после операции показан на рисунке 3F. Учитывая достаточно времени для восстановления после операции, разрезы должны быть закрыты и носовой полости лишенный NALT (рис. 3G).

Типичные экспериментальные результаты, полученные с помощью этих методов показано на рисунке 4, сравнивая ткани культуральной жидкости и биологических образцов из исследования стафилококковой вакциной субъединицы (STEBVax). Мыши вводили интраназально по STEBVax (IN) или внутрибрюшинно (IP) маршруты. Вакцина была разработана с адъювантной который активирует Toll-подобный рецептор 4 пути ^3,1 4 и контроля были даны только физиологическим раствором или вакцина без адъюванта. Искусственный NALT получена из экспериментальных групп выделяется антиген-специфические иммуноглобулины в среду, что было измерить с помощью ИФА. В данном примере (рис. 4а), результаты показывают, что наибольшее количество IgA были освобождены NALT, полученных от мышей, вакцинированных в с субъединицей вакцины в сочетании с адъювантной.

Биологические образцы (например, сыворотка, слюна, носовые выделения, выделения из влагалища), приобретенных от контроля или NALT без мыши можно использовать для профилирования в естественных условиях иммунный ответ на антигены носовой для сравнения с результатами тканевой культуры. На рисунке 4В, IgA и IgG В ответ на вакцинацию были значительно снизилась без функциональных NALT. Уровни антиген-специфических IgA, как правило, больше, чем IgG в слизистой секрет (слюна, носовые мойки) привитых мышей.

upload/3960/3960fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схема NALT сбора и бывший культивирование естественных условиях.

Рисунок 2. Визуализация мыши неба с указанием должности разреза NALT и хирургии. Размер и расположение верхнего неба с операции разрез обозначается пунктирной линией (А), верхнего неба вырезана (B) или окрашивают в гематоксилин (C), чтобы просмотреть параллельно NALT в премоляра области неба (пятна темно-фиолетового на передней стороне неба ). NALT указано стрелками.

Рисунок 3. Хирургическое нарушение NALT. Основные этапы операции NALT нарушения: лежа вид мышей верхнего неба до операции (А); срединный разрез, сделанный на верхнем небе для доступа к NALT (B); microcurette зонд вводится через срединный разрез сорвать NALT структурыЦелостность (C), прижигание разреза при заключении хирургии (D). Микроскопическое изображение полости носа, H & E пятнами, до операции (E), сразу после операции (F), а также успешно исцелил, NALT без мыши (G).

Рисунок 4. Вакцин, специфических антител из культивируемых NALT, слюна, носовые выделения и собраны из вакцинированных мышей. NALT свободного или нормальных мышей контроль были вакцинированы или IP с STEBVax и биологические образцы были собраны. Уровень антител в трех образцов были измерены с помощью иммуноферментного анализа. (A) NALT были исключены из контрольных мышей (не хирургическим путем манипуляций) и культивировали для изучения антител. Вакцина конкретных IgA ответ в культуре у вакцинированных мышей статистически отличается от контроля (Стьюдента-тест, р ≤ 0,01, по сравнению с отсутствием адъювантной вакцины или нет). (B) NALT нарушения существенно сократить конкретных антителВ к вакцинации. Существовали значительные различия между отдельными уровнями антител NALT и NALT + группы (без хирургического вмешательства или контроля операции) для всех сравнений, кроме слюны результаты IgG (Стьюдента-тест, р ≤ 0,05).

Обсуждение

Мы представили коллективные методы разработки модели животных, получения биологических образцов и анализов для изучения NALT связанных иммунных реакций ^1-4. Есть и другие факторы, чтобы рассмотреть в ходе выполнения этих методов. Стандартные стерильные методы хирургии и культуры тканей должны быть соблюдены. Сочетание антибактериальные и противогрибковые средства, используемые при выделении и культуры, а также поддержание стерилизовать инструменты, рабочая зона, и дезинфицировать вкус позволит снизить риск заражения. Слюна, носовые моет и аналогичные образцы слизистой секрецией должны быть проверены на предмет возможного загрязнения кровью, как сывороточные антитела, как правило, содержится в высоких концентрациях. Кроме того, слизистые выделения должны быть слегка разбавленный для анализа, поскольку более низкие концентрации антител, присутствующих в этих образцах по сравнению с сывороткой.

Мыши должны быть теплыми непосредственно после операции, предварительновыход потенциал анестезии вызванной гипотермией. Альтернативные отдыха мыши на боку в течение послеоперационного восстановления, чтобы минимизировать нерегулярные дыхания. Хирургическая процедура является более эффективным с трех человек, работающих вместе для выполнения этих задач: одна выполняет операции, одна для оказания помощи в проведении открытым ртом, и одной обеспечить послеоперационный уход, мышей оправиться от наркоза.

Необходимо использовать H & E окрашивания черепной сечения в конце всех экспериментальных процедур или исследований для проверки успешности операции для каждой мыши. Возможные результаты операции являются: полное и двусторонним NALT абляции, неполное удаление или NALT нетронутыми. Потому что не все операции приведет к полной потере NALT, животных с остаточной или нетронутыми NALT может быть использован в качестве внутреннего контроля. Другим потенциальным результатом является то, что небо не удается полностью излечить, оставляя отверстие подключения носа и полости рта. Неполныйзаживление неба приведет к малому весу и нарушения развития, и эти люди должны быть исключены из исследования.

Изучение вакцины ответы сначала с мышиной модели послужит созданию роль NALT в предполагаемый результат исследования (иммунного ответа, выживаемости и т.д.). Хирургическим удалением NALT облегчает определение носовой вклад в местных и системного иммунитета. Хирургический подход, описанный здесь, является наиболее прямой способ получения модели мыши лишенные NALT. Выберите нокаут мышах, как сообщается, отсутствие NALT, но эти животные также являются дефицит цитокинов и хемокинов важное значение для развития других вторичных лимфоидных тканей, и может питать дополнительные дефекты ^12,13. Кроме того, методы, описанные здесь, были разработаны для изучения некоторых аспектов иммунных реакций, происходящих в носовые ходы. Наши экспериментальные результаты основаны на исследованиях с использованием всей верхней Палатоме от мыши на культуре ткани, хотя не исключено, что участки могут быть использованы. И, наконец, культурные модели NALT полезна для проведения экспериментов полностью в культуре ткани.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Нержавеющая сталь стерильные хирургические лезвия, № 11	MILTEX	4-311
Рукоять ножа, № 3	MILTEX	4-7
48-луночных культуре клеток	Costar	3548
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Эмбриональной телячьей сыворотки, тепло инактивированная	Гибко / Invitrogen	16000-044	Окончательный Конц: 10% по объему в культуре средств массовой информации
Стрептомицина сульфата	Сигма	S9137	Окончательный Конц: 100 мкг / мл
Пенициллин	Сигма	P7794	Окончательный Конц: 100 UI / мл
Гентамицин	Sigma-Aldrich	G1397-10ML	Окончательный Конц: 50 мкг / мл
Fungizone	Гибко / Invitrogen	15290-018	Окончательный Конц: 1 мкг / мл
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	Окончательный Конц: 10 мМ
Трубы Эппендорф Микроцентрифуга	Эппендорф	022364111
Nutra-гель Черри ароматизированные мыши влажный корм	Био-Подавайте	S4798-TRAY
Metacam	Boehringer Ingelheim	601531000	Одна капля 1,5 мг / мл Устная Приостановка
Кетамин	Pfizer	00856440301	Окончательный Coпс: 6.06 мг / мл
Acepromazine	Vedco	VEDC207	Окончательный Конц: 0,061 мг / мл
Ксилазин	Ллойд	4811	Окончательный Конц: 0,667 мг / мл
Puralube Vet мазь	Pharmaderm здоровья животных	1621
0,9% раствор хлорида натрия инъекций USP	Бакстер	2B1302
0,5 мм Microcurette	Roboz	RS-6350
Тепловая единица Прижигание	Счетчик Гейгера	150-S/150A-S
Жало ГТС, прямой изобразительных Loop	Счетчик Гейгера	214
Хирургические ножницы
10% нейтральный буферный формалин	Сигма	HT501128
Муравьиная кислота	Рыбак	A119P-4	Смешайте 426 мл муравьиной кислоты в 1047 мл водопроводной воды, затем добавляют 45 мл Rexyn 101 (H)
Rexyn 101 (H)	Рыбак	R231-500
Ткань-Tek VIP E150/E300	Сакура
Ротари Микротом	Leica	RM2255
Гематоксилин Майера	Сигма	MHS16-500ML
Гилл № 1 гематоксилин	Сигма	GHS116
Eosin B	Сигма	2853
Microtainer сыворотки сепаратор	BD Medical	365956
Фосфатного буфера			100 мМ NaH 2 PO 4, 140 мМ NaCl, рН 7,4
Ингибитор протеазы коктейль, ЭДТА бесплатно	Thermo Scientific	78415