Использование газовой хроматографии для анализа изменения состава жирных кислот в ткани печени крыс во время беременности

Резюме

Беременность приводит к значительным изменениям в составе жирных кислот материнских тканей. Профили липидов могут быть получены с помощью газовой хроматографии, чтобы идентификация и количественное определение жирных кислот в отдельных классов липидов среди крыс, которых кормили различные высокие и низкие жиров диеты во время беременности.

Аннотация

Метод газовой хроматографии (ГХ) является высокочувствительным методом, используемым для идентификации и количественного содержания жирных кислот липидов из тканей, клеток и плазмы / сыворотки, дает свои результаты с высокой точностью и высокой воспроизводимости. В исследованиях метаболических и питания GC позволяет оценить изменения концентрации жирных кислот следующих мероприятий или во время изменений в физиологическом состоянии, как беременность. Добыча твердой фазы (SPE) с помощью аминопропил кремнезема картриджей позволяет разделение основных классов липидов, включая триацилглицеринов, различных фосфолипидов, и эфиров холестерина (CE). ГК в сочетании с SPE был использован для анализа изменений в составе жирных кислот СЕ фракции в печени целинных и крыс, которые были кормили различные высокие и низкие жиров диеты. Существуют значительные эффекты взаимодействия диета / беременность от содержания омега-3 и омега-6 жирных кислот печени CE, указывая, что беременные самки имеют различный ответ на диетического manipulatионный, чем видно среди девственных самок.

Введение

Метод газовой хроматографии (ГХ) является устоявшихся метод, используемый для идентификации и количественного включение жирных кислот в липидные бассейнов и клеточных мембран ^1,2 во добавок или физиологических условиях, таких как ожирение (и связанных с ним заболеваний, таких как диабет) или беременности ^{3 - 5.} Он также подходит для анализа типов и количеств жиров в пищевых продуктах. Это полезно при характеристике экспериментальные диеты, а также обеспечение того, чтобы пищевой промышленности соответствует нормам. Например, ГК может быть использован для подтверждения личности и количество жирных кислот внутри продукта, таких как пищевая добавка для того, чтобы маркировка является правильным и правила будут соблюдаться ^6,7. Анализ жирных кислот может обеспечить ценную информацию липидного обмена в норме и патологии, влияние изменения рациона питания, а также влияние изменений в физиологическом состоянии ^8. Использование GC изучать образцы во время беременности оказывает важноеинформация об изменениях в жирной кислоты и сложного липидного гомеостаза ^3.

В преддверии хроматографического разделения, липиды, как правило, извлекается из образца с помощью растворимости липидов в смеси растворителей хлороформ-метанол. Хлорида натрия, чтобы облегчить разделение смеси на водную и органическую фазы, содержащей липид ^9,10. Сложные классы липидов интереса может быть отделен от общего липидного экстракта путем твердофазной экстракции (SPE). Этот метод разделения элюирует классы липидов на основе их полярности или аффинность связывания. Triacyglycerols (TAG) и сложные эфиры холестерина (CE), элюируют сначала в виде комбинированного фракции, еще классов, фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин (PE), и не этерифицированные жирные кислоты (NEFA), элюируют, увеличивая полярность элюирующего растворителя . Разделение TAG от CE использует связывание TAG только к свежим SPE патроныDGE, позволяя CE Элюируемый. TAG может быть затем элюировали путем увеличения полярность, элюируя ^9,10 растворителя. Этот метод позволяет несколько образцов должны быть разделены одновременно с более высоким выходом, чем достигается при тонкослойной хроматографии, что означает, что относительно небольшие размеры образцов (например, <100 мкл плазмы или сыворотки, <100 мг ткани) могут быть проанализированы ^11,12.

GC является хорошо отработанной технологией впервые описан в 1950; было предположено, что подвижная фаза в системах затем жидкость-жидкость может быть заменена с паром. Изначально он использовался для нефтяной анализа, но быстро расширяется в других областях, таких как аминокислотного анализа и липидов биохимии, которая по-прежнему большой интерес. Успехи в GC оборудования и технологий, таких как развитие капиллярных колонок из ранее использовавшихся упакованных колонках привело к наших текущих методов, в которых жирные кислоты способны бытьразделенных более эффективно при более низких температурах приводит к GC используется обычно для идентификации и количественного определения жирных кислот в широком диапазоне исследований ^13.

GC требует жирные кислоты должны быть получены производные с тем, что они могут стать достаточно летучи, чтобы быть элюировали при разумных температурах без термического разложения. Это обычно включает замещение функциональной группы, содержащей водород с образованием сложных эфиров, сложные тиоэфиры или амиды для анализа. Метиловых эфиров обычно изучали производные, которые производятся путем метилирования. В этом методе сложноэфирные связи в сложных липидов гидролизуют, чтобы освободить свободные жирные кислоты, которые transmethylated с образованием метиловых эфиров жирных кислот (FAME). В результате профиль FAME, определяется GC, называют состава жирных кислот и могут быть легко по сравнению между различными экспериментальными группами ^9,10. Методика позволяет обе пропорции отдельUAL жирные кислоты и их концентрации должны быть измерены.

В дополнение к использованию GC для анализа жирных кислот в питании исследований и в пищевой промышленности, методика может быть использована в широком диапазоне аналитических областей. Например, экологические анализы с использованием GC включают измерения загрязнения воды инсектицидами и почвы анализирует измерения содержания хлорбензол. В токсикологии, GC также используется для выявления запрещенных веществ в моче и образцах крови лиц; такие спортивный производительности усилители ¹² и способность отделить сложные смеси углеводородов делает этот метод популярен в нефтяной промышленности для нефтехимической анализа ^12.

Беременность связана со значительными изменениями в жирнокислотного состава материнской тканей, специально в содержании омега-3 (N-3) и омега-6 (п-6) полиненасыщенных жирных ациспуск (ПНЖК) ^3. В текущем исследовании, мы иллюстрируют использование GC в измерении жирных кислот, описывая его использование в анализе состава жирных кислот ткани печени, взятой из целинных и беременных крыс кормили низкие и высоким содержанием жиров диеты с различными источниками нефти. Экспериментальные диеты, приведенные здесь были масляной основе диеты с низким содержанием жира сои, с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты сои (130,9 г Всего жиров / кг жиров) или с высоким содержанием жиров на масляной основе диеты льняное (130,9 г Всего жиров / кг диета), при условии течение 20 дней. Состав кислота полный питательных веществ и жирных из этих диет были описаны ранее ^14. Нефтяные диеты сои богаты линолевой кислоты (18:02 н-6) и содержат некоторое количество α-линоленовой кислоты (18:03 н-3), когда диета масло льняное богат α-линоленовой кислоты. Эти высоким содержанием жиров диеты представляют различные рационы линолевой к α-линоленовой кислот (рационах 8:01 и 1:1, соответственно). Метод выделения отдельных классов липидов и анализа ГХ, мыLL создана и утверждена, и был опубликован ранее ^10, но без подробное техническое описание найденного здесь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Процедуры животных

1. Все животные работа должна проводиться в соответствии с домашнего офиса животных (научные процедуры) Закон (1986).
2. Mate крыс линии Вистар в возрасте 10 недель на моногамных разведения и подтвердить беременность появлением вагинального вилкой. Запишите это как 1-й день беременности, и начать экспериментальную диету. Для целинных женщин, дом каждой крысы индивидуально, и начать экспериментальную диету.
3. После кормления экспериментальных диет в течение 20 дней усыпить крысы по CO ₂ удушья с последующим смещением шейных позвонков.
4. Используйте рассечение пинцет и ножницы, чтобы разоблачить брюшной полости и вырезать печень, сокращая связки, соединяющие печень к диафрагме, переднюю стенку живота, желудка и двенадцатиперстной кишки. Промойте печень в PBS и заморозить в жидком азоте перед хранением при -80 ° С

2. Подготовка общих липидов Экстракт ⁹

1. Добавить moleculар сита (заполнить 1/10 емкости растворителя) для всех растворителей для создания «сухой» растворители. Выполняйте все работы растворителя в вытяжной шкаф.
2. Отрежьте около 100 мг мороженой печени и весят. Поместите ткань в трубку в ведро со льдом и добавить 0,8 мл ледяной 0,9% NaCl. Однородный ткани.
3. Добавить внутренние стандарты растворяют в 1 мл / мг сухого хлороформа и метанола (2:1, об / об), содержащей бутилированный гидрокситолуол (ВНТ, 50 мг / л) в качестве антиоксиданта. Для 100 мг печени крыс добавить 100 мкг стандарта CE (холестерилацетат heptadecanoate 17:00) Внимание:. Хлороформ и ВНТ опасны.
4. Добавить 5,0 мл сухого хлороформ: метанол (2:1, объем / объем), содержащий ВНТ (50 мг / л).
5. Добавить 1,0 мл 1 М NaCl, тщательно перемешать встряхиванием, пока смесь не выглядит однородным. Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
6. Центрифуге при 1000 х г в течение 10 мин, низкий тормоза при комнатной температуре.
7. Сбор нижефазы с использованием стекла пипетки Пастера, трансфер в новой винтовой крышкой стеклянной трубкой и сухой атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.

3. Разделение липидов классов по твердофазной экстракции (SPE) ¹⁰

1. Соедин ют баллон с SPE с вакуумным насосом и поместить аминопропил кремнезема SPE картридж на резервуаре.
2. Поместите новый винт-крышка стеклянная трубка с надписью TAG и CE в баке стойки под колонки собрать первую фракцию.
3. Растворите общее липидный экстракт в 1,0 мл сухого хлороформа и вихревых.
4. Применить образец колонки, используя стекло пипетки Пастера и позволяют капать через в завинчивающейся крышкой трубки под действием силы тяжести. Когда никакие дальнейшие капает не упасть, удалите оставшуюся жидкость с помощью вакуума.
5. Элюции TAG и CE фракции под вакуумом, колонку промывают 2 х 1,0 мл моет сухого хлороформа.
6. Когда вся жидкость удаляется, высушить TAG и CE fractioн в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
7. Поместите новый завинчивающейся крышкой стеклянной трубки с надписью ПК в лоток бака в столбце.
8. Элюции фракции PC под вакуумом с добавлением 2 х 1,0 мл сухого хлороформ: метанол (60:40, об / об), пока вся жидкость не будет удален из колонки.
9. Снимите и сухая фракция ПК в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
10. Установите новую завинчивающейся крышкой стекло PE пробирку в лоток резервуара и элюируют фракцию PE с добавлением 1,0 мл сухого метанола в вакууме.
11. Удалить и сухой ЧП фракция в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
12. Поместите новый завинчивающейся крышкой стеклянную трубку помечены NEFA в лоток резервуара и элюируют фракцию NEFA под вакуумом при добавлении 2 х 1,0 мл промывками безводного хлороформа, метанола и ледяной уксусной кислоты. (100:2:2, об / об / об) Предостережение: ледяной уксусной кислоты опасными.
13. Удалить собранную NEFA фракции и сухой атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
14. Установите новую аминопропил кремнезема SPE картридж на SPE бака и поместите стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой в лоток бака под патрон для сбора отходов.
15. Промыть колонку с 3 стирок сухого гексана в вакууме, а затем окончательного 1,0 мл стирки под действием силы тяжести. Не допускайте, чтобы картридж становиться сухой (поворот каналы столбцов картридж в закрытое положение, когда уровень гексан близка к матрице картриджа). Внимание: гексан является опасным.
16. Заменить отходов трубку с новым винтовой колпачок стеклянной трубки с маркировкой CE.
17. Растворите высушенного TAG и CE фракцию (полученного на стадии 3.6) в 1,0 мл сухого гексана и вихря. Примените это к колонке с использованием стекла пипетки Пастера и позволяют капать через под гravity.
18. Когда никакие дальнейшие капает не упасть, удалите оставшуюся жидкость в вакууме.
19. Под вакуумом, колонку промывают 2 х 1,0 мл моет сухого гексана элюироваться CE и сухой собранную фракцию в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.
20. Поместите новый винт-крышка стеклянная трубка с надписью TAG в лоток резервуара и Элюции TAG с добавлением 2 х 1,0 мл моет сухого гексана: метанол: этилацетат (100:5:5) в вакууме.
21. Сухой Собранную фракцию в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничены и хранили при -20 ° С на данном этапе для до недели. Внимание: этилацетат является опасным.

4. Подготовка FAME от Е ¹⁰

1. Добавить 0,5 мл сухого толуола, отделенной CE фракции (собраны в шаге 3.19) и вихрь. Внимание: толуол является опасным.
2. Подготовка метилирования реагента (сухой метанол с 2% (об/ Объем) H ₂ SO _4), из которых 1,0 мл требуется на образец. Внесите объем сухого метанола в стекло или подходящий пластиковый контейнер с крышкой и добавьте необходимое количество H ₂ SO ₄ каплям затем смешать инверсией. Внимание: Серная кислота является опасным.
3. Добавить 1,0 мл метилирующего реагента для образцов, растворенных в сухом толуоле, колпачок пробирки надежно, и осторожно перемешать.
4. Нагрейте образцы в течение 2 часов при 50 ° С
5. Через 2 часа снять трубки от жары. После прохладной добавить 1,0 мл нейтрализующие решение (0,25 М _КНСО3 0.5MK ₂ CO _3). Внимание: Калий бикарбонат и карбонат калия являются опасными.
6. Добавить 1,0 мл сухого гексана и вихревые.
7. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин, низкий тормоза при комнатной температуре.
8. Соберите верхнюю фазу, которая содержит FAME, и передать в новую, не завинчивающейся крышкой одноразовые стеклянной трубки.
9. Высушите собранную FAME подазота при 40 ° С Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до недели.

5. Удаление свободного холестерина загрязнения от CE FAME ¹⁴

(Бесплатный Холестерин может загрязнить образец; см. рисунок 1 Например хроматографа следов с и без удаления свободного холестерина).

1. Поставьте отходов трубку в SPE бака и поместите силикагелевого SPE картридж на танк.
2. Столбец Промыть 3 х 1 мл моет сухого гексана в вакууме и 1 х 1 мл под действием силы тяжести.
3. Удалить моет отходов и добавить новую трубку отходов в баке.
4. Растворите CE FAME в 1 мл сухого гексана, вихря.
5. Нанести на колонки, используя стекло пипетки Пастера и позволяют капать через под действием силы тяжести.
6. Столбец Промыть 3 х 1 мл моет гексана в вакууме.
7. Удалить моет отходов и поместите новый неофициальный завинчивающейся крышкой трубки в бак помечены CE FAME.
8. ЭлюцииCE FAME с 2 х 1 мл сухого гексана: диэтиловый эфир (95:5 об / об) моет.
9. Высушите в атмосфере азота при 40 ° С Образцы могут быть ограничены и хранили при -20 ° С на данном этапе для до недели. Внимание: диэтиловый эфир является опасным.

6. Передача FAME в GC автосэмплера флакон

1. Добавить 75 мкл сухого гексана, чтобы пробовать, вихрь, и перенести в авто образца флаконе GC.
2. Добавить еще 75 мкл сухого гексана, чтобы пробовать, вихревые и трансфер в той же GC авто образца флаконе. Образцы могут быть ограничен и хранили при -20 ° С на этой стадии до одного месяца.

7. Анализ с помощью газового хроматографа ¹⁴

1. Анализ FAME на газовом хроматографе. Пример настройки: 30 м 0,25 мкм х 0,25 мм BPX-70 из плавленого кварца капиллярная колонка с протоколом температуры:
   Начальная температура 115 ° С, провести 2 мин, рампа 10 ° С / мин до 200 ° С, удерживая 18,5 мин, рампы 60 ° С / мин до 245 ° С, чстарый 4 мин.
   Колонка: Гелий газ, расход 1,0, давление 14,6 и скорость 29.
   Инжектор: температура = 300 ° С.
   Детектор: Водород поток 40.0, воздушный поток 184,0, составляют газа гелий, расход 45,0, температура = 300 ° С.
2. Установить сплит соотношение в зависимости от обстоятельств (например, 25:1 для CE анализа FAME).
3. Определить площадь под каждым пиком, используя соответствующее программное обеспечение и определить FAME по сравнению со стандартами. См. Рисунок 2 Например хроматограмм.
4. Использование площадь под пиком данных для вычисления вклада индивидуальных жирных кислот в процентах от общего количества жирных кислот.
5. Рассчитать абсолютные концентрации жирных кислот путем деления площади внутреннего стандарта на величину добавлен. Разделить площадь каждой жирной кислоты этим результатом, чтобы получить абсолютные концентрации каждого жирной кислоты в количестве ткани, используемой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Успех этого метода зависит от следующих протокол точно и на использовании чистых растворителей и реагентов, чтобы уменьшить "шум" и загрязнения, которые могут появиться на хроматограмме. Загрязненные образцы являются более сложными для анализа, снижения точности площади под рас?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Газовая хроматография является точным метод, используемый для анализа жирных кислот, и его высокая воспроизводимость считает эту технику, подходящую для клинических анализов. Соответствующие столбцы GC должен использоваться для того, чтобы идентифицировать жирных кислот, представля?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol	Fisher Scientific	M/4056/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Chloroform	Fisher Scientific	C/4966/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
BHT	Sigma- Aldrich	W218405	'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Anhydrous
Hexane	Fisher Scientific	H/0406/17	'CAUTION' Fumes - HPLC Grade
Glacial acetic acid	Sigma- Aldrich	695084	'CAUTION' Burns - 99.85%
Sulfuric acid	Sigma- Aldrich	339741	'CAUTION' Burns - 99.999%
Potassium carbonate	Sigma- Aldrich	209619	99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate	Sigma- Aldrich	237205	99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate	Fisher Scientific	10204340	'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied
Toluene	Fisher Scientific	T/2300/15	'CAUTION' Fumes
Diethyl ether	Sigma- Aldrich	309966	'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder	BOC	44-w	'CAUTION' Compressed gas - explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges	Agilent	12102014	Cartridge - Bead mass 100 mg
Silica gel SPE cartidges	Agilent	14102010	Cartridge - Bead mass 100 mg
Molecular seives	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1.6 mm
Glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	FB50251