АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Состояние здоровья легкого отражается типом и числом иммунных клеток, которые присутствуют в бронхиолах легких. Мы описываем метод бронхоальвеолярного лаважа, который позволяет изолировать и исследовать неадгезивные клетки и растворимые факторы из нижних дыхательных путей мышей.

Аннотация

Bronchoalveolar Lavage (BAL) - экспериментальная процедура, которая используется для исследования клеточного и бесклеточного содержимого просвета легких ex vivo, чтобы получить представление о текущем состоянии болезни.

Здесь описывается простой и эффективный метод выполнения БАЛ на легких мыши без использования специальных инструментов или оборудования. Жидкость БАЛ выделяют путем введения катетера в трахею мышей с терминальной анестезией, через которые в бронхиолы вводят солевой раствор. Приложенная жидкость мягко убирается, чтобы максимизировать извлечение флюида BAL и минимизировать усилия сдвига. Этот метод позволяет сохранить жизнеспособность, функцию и структуру клеток в дыхательных путях и БАЛ.

Для получения более глубокого понимания состояния болезни легких могут применяться многочисленные методики. В этом случае широко используемым методом идентификации и подсчета различных типов иммунных клеток являетсяГде проточная цитометрия комбинируется с панелью выбора флуоресцентно меченных клеточных поверхностно-специфических маркеров. Представленная здесь процедура BAL также может быть использована для анализа инфекционных агентов, жидких компонентов или ингаляционных частиц в легких мыши.

Введение

Воздушные пути встречаются многочисленные оскорбления, которые могут привести к воспалению, инвазии патогенов или злокачественные трансформации. Эпителиальные клетки, которые выстилают просвет легких, образуют один из главных барьеров тела млекопитающих. Вместе с альвеолярными макрофагами они предотвращают проникновение экологических угроз в системную систему через дыхательные пути. Примеры таких угроз включают органические и неорганические химикаты, бактерии и вирусы. Аналогичным образом, могут быть разработаны специальные иммунизации или терапевтические вмешательства, направленные на легкие. Во всех этих случаях тщательный анализ вызванного ответа важен для понимания, вмешательства или предотвращения биологических процессов, происходящих в дыхательной системе.

Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) является бесценным методом для анализа таких ответов, поскольку полученные в результате образцы содержат важную информацию о воспалительных реакциях, иммунных механизмах и прогрессировании инфекционных заболеванийЧто может произойти в легочных дыхательных путях 1 , 2 . Используя БАЛ, можно изучать инфильтрирующие клетки. Это контрастирует с переваренными легкими, которые дают «грязнее» клеточную популяцию, со многими мертвыми и липкими клетками. БАЛ выполняют путем введения солевого раствора в конечные бронхиолы и последующего восстановления этого раствора. Полученное решение можно затем использовать для количественной оценки и фенотипического анализа резидентных легких и инфильтрирующих воспалительных клеток. Этот метод часто применяется для изучения клеточного притока в моделях заболеваний дыхательных путей, таких как астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и модели инфекционных заболеваний. Помимо клеточного состава, молекулярный состав легочных дыхательных путей также отражается в жидкости БАЛ. Для анализа этого фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), иммуноблот и одновременный анализ нескольких цитокинов с помощью массива цитокинов могут бытьпроводится для оценки наличия цитокинов и хемокинов.

БАЛ является хорошо признанным методом для изучения притока воспалительных клеток в воспалительных моделях животных респираторных болезней. Наблюдение измененного клеточного притока (например, повышенные уровни лимфоцитов, эозинофилы, нейтрофилов или) может привести к более глубокому пониманию болезни и может быть объективным параметр для оценки эффективности терапевтического вмешательства.

Точная и воспроизводимая интерпретация BAL клеточного анализа требует, чтобы БАЛ выполнена правильно, и что собранные жидкости и обрабатываются должным образом. Термин «бронхиальная промывание» была введена более восьмидесяти лет назад Ститтой 3. В 1961 году Myrvik получены альвеолярных макрофагов из промывной жидкости кролика легких 3. BAL теперь широко используемый метод для анализа и мониторинга легких в модели мыши, однакоRe по-прежнему не представляет собой стандартную процедуру БАЛ в научной литературе 4 , 5 . Кроме того, существует, вероятно, так много способов выполнить БАЛ, поскольку существуют исследовательские лаборатории, использующие технику 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Важно, что данные, полученные из БАЛ, представляют собой целое мышечное легкое, а не только часть легкого. Такая вариативность затрудняет интерпретацию и сравнение результатов между различными испытаниями.

Здесь описана базовая, недорогая и воспроизводимая процедура BAL, которая позволяет собирать клеточную и растворимую фракцию, присутствующую в просвете дыхательных путей мыши. Короче говоря, катетер помещают в открытую трахею oFa - терминально обезболиваемая мышь. С катетером соединен шприц, и в легкие вводится буферный солевой раствор, содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). Пробу легкого отбирают путем мягкой повторной промывки солевого раствора с помощью плунжера. Отрицательное давление, прилагаемое на этом этапе, минимально, чтобы предотвратить обрушение дыхательных путей. После сбора полученная БАЛ должна быть обработана далее для перечисления и идентификации клеток методом проточной цитометрии.

протокол

Все эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, проводились в соответствии с национальным законодательством (бельгийский закон 14/08/1986 и 22/12/2003, Королевский указ Бельгии 06/04/2010) и европейским законодательством (директивы ЕС 2010/63 / ЕС и 86 / 609 / ЕЕС). Все эксперименты на мышах и всех животных протоколах были одобрены комитетом по этике университета Гента (номера LA1400091 и EC2016-027).

1. Подготовка

  1. Жидкая жидкость
    1. Приготовить сбалансированный солевой раствор с 100 мкМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для измерения уровня белка в жидкости БАЛ рекомендуется добавлять ингибиторы протеазы, чтобы предотвратить активность протеазы в жидкости БАЛ.
  2. Катетер
    1. Сделайте катетер, вставив иглу 23 G в прозрачную пластиковую полиэтиленовую трубку 21 G (внутренний диаметр: 0,58 мм, наружный диаметр: 0,965 мм и длина: 0,5 см). Также могут быть использованы предварительно подготовленные катетеры.
  3. Anesthпоэтика
    1. Подготовьте терминальный анестетик, предпочтительно тот, который вызывает остановку дыхания ( например, барбитурат, такой как раствор пентобарбитала натрия (> 100 мг / кг) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS)).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется использовать инъекционную анестезию вместо ингаляционной анестезии, так как вдыхаемая анестезия может влиять на содержание БАЛ. CO 2 , например, оказывает влияние на pH крови и, следовательно, на перераспределение различных соединений 12 .
  4. Буфер лизиса эритроцитов аммония-хлорид-калий (ACK)
    1. Подготовьте ACK-лизисный буфер, растворяя 8,29 г NH 4 Cl и 1 г KHCO 3 в 1 л H 2 O со 100 мкМ ЭДТА; Эритроцит эритроцитов также можно приобрести у внешнего источника.

2. Выполнение бронхоальвеолярного лаважа (BAL)

  1. Введение катетера в трахею
    1. Усыпите мышь путем внутрибрюшинной инъекции смертельной дозы анестетика барбитурата короткого действия с использованием иглы 26 G. Чтобы подтвердить правильную смертельную анестезию, зажмите заднюю лапу мыши пинцетом, чтобы проверить рефлекс стопы.
    2. Поместите животное на спину на хирургическую пластину и зафиксируйте мышь, придавив конечности.
    3. Спрей 70% этанола на шее для дезинфекции. Сделайте разрез в области шеи возле трахеи с помощью скальпеля.
    4. Откройте кожу, чтобы обнажить слюнные железы. Отделите слюнные железы, используя щипцы, чтобы обнажить стерниоидную мышцу. Вставьте мышцу вокруг трахеи, используя щипцы, чтобы обнажить трахею.
    5. Поместите хлопковую нить под трахею с помощью клещей.
    6. Тщательно проколоть середину обнаженной трахеи между двумя кольцами хряща иглой 26 G. Будьте осторожны, чтобы не повредить трахею.
    7. Вставьте катетер около 0,5 см в трахею. Убедитесь, что катеTer не вставляется слишком глубоко в трахею, так как это может привести к повреждению структуры легких.
    8. Стабилизируйте катетер, завязывая трахею вокруг катетера, используя хлопковую нить, установленную на этапе 2.1.5. Если катетер недостаточно завязан, вводимый сбалансированный солевой раствор может течь в верхнюю часть дыхательного тракта, а не вниз в легкие.
  2. Соберите промывную жидкость
    1. Загрузите шприц объемом 1 мл 1 мл стерильного сбалансированного солевого раствора со 100 мкМ ЭДТА.
    2. Подключите шприц объемом 1 мл к катетеру и аккуратно введите раствор соли / ЭДТА в легкие.
    3. Аспирируйте раствор мягко, массируя грудную клетку мыши. Если аспирационная жидкость не видна в шприце, осторожно вставьте катетер немного дальше или вверх по трахее.
    4. Снимите шприц с иглы и перенесите восстановленную промывочную жидкость в 15 мл пробирку, помещенную на лед. Обычно, 700 - 900 &# 181; L БАЛ выделяют из 1 мл инъецированного раствора.
    5. Повторите шаги 2.2.1 - 2.2.4 два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если целью является анализ не клеточного содержимого, рекомендуется сосредоточить собранные образцы, когда есть проблемы с чувствительностью.

3. Сбор клеточных и неклеточных компонентов БАЛ-жидкости

  1. Центрифугируйте промывную жидкость в течение 7 минут при 400 xg и 4 ° C.
  2. Собирают супернатант и немедленно используют его для дальнейшего анализа ( например, ELISA) или замораживают при -80 ° C. Держите клеточный осадок, чтобы проанализировать клеточный приток в легких.
  3. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл ACK лизирующего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап обеспечивает лизис эритроцитов, сохраняя при этом белые кровяные клетки неповрежденными.
  4. Инкубируйте в течение 2 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы уменьшить вариацию, вызванную лизисами эритроцитов, этот шаг не должен выполняться более 2 мин.
  5. Добавить 1 мл холодного PBS для разбавления ACK лизирующего буфера.
  6. Центрифуга в течение 7 минут при 400 xg и 4 ° C. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки в адекватном объеме PBS для последующего анализа (см. Ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Объем PBS зависит от последующего исследования, которое будет выполняться.

4. Анализ различных типов клеток в жидкости BAL с помощью проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ. Одна из возможностей заключается в анализе абсолютного и относительного клеточного состава жидкости БАЛ путем проведения проточной цитометрии. Цель этой статьи - разработать технику BAL. Проточная цитометрия является специализированной методикой сама по себе. Рекомендуется читать специализированные статьи по методу проточной цитометрии 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Антитела, связанные с флуорофором tшлю распознают поверхностные антигены (таблица 1) , специфические для конкретного типа клеток (ов) используются. При использовании стратегии стробирования, можно определить Т-клетки, макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, эозинофилы, нейтрофилы и в клеточной фракции BAL.

антиген Тип клетки
Кластер дифференцировки 3 (CD3) Выраженный на Т-клетках
Кластер дифференцировки 11с (CD11c) Высокая экспрессия на большинстве дендритных клеток, но и на моноциты, макрофаги, нейтрофилы и некоторых В-клеток.
Кластер дифференцировки 11b (CD11b) Экспрессируется на поверхности многих лейкоцитов, включая моноциты, нейтрофилы, естественные клетки-киллеры, гранулоциты и макрофаги.
SiglecF lveolar макрофаги и эозинофилы.
MHCII Обычно встречаются только на антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки, мононуклеарных фагоцитов и В-клеток.
CD19 В-лимфоцитов антиген
Ly-6G Маркер для моноцитов, гранулоцитов и нейтрофилов

Таблица 1: Выбор иммунных антигенов клеточной поверхности. В этой таблице приведен список поверхностных эпитопов, используемых для характеристики различных типов клеток. Комбинации нескольких маркеров должны будут надежно определить конкретный тип клеток.

образцы
туба Антиген-флуорофором , которые будут добавлены к клеткам Концентрация запаса антител (мг / мл) Разведение антител Общий объем (мкл)
Фиксируемая жизнеспособность красителя 0.2 1/1000 50
CD11c 0.2 1/800 50
SiglecF 0.2 1/100 50
Образец X MHCII 0.2 1/200 50
CD3 0.2 1/200 50
CD19 0.2 1/200 50
CD11b 0.2 1/200 50
Ly6G 0.2 1/200 50
Управление напряжением
туба Антиген-флуорофором , которые будут добавлены к клеткам Концентрация антител запаса (мг / мл) Антитело разведение Общий объем (мкл)
Неокрашенные клетки / / / 50
Одиночные окрашенные клетки Fixable жизнеспособность красителя 0.2 1/1000 50
Одиночные окрашенные клетки CD11c 0.2 1/800 50
Одиночные окрашенные клетки SiglecF 0.2 1/100 50
Одиночные окрашенные клетки MHCII 0.2 1/200 50
Одиночные окрашенные клетки CD3 00,2 1/200 50
Одиночные окрашенные клетки CD19 0.2 1/200 50
Одиночные окрашенные клетки CD11b 0.2 1/200 50
Одиночные окрашенные клетки Ly6G 0.2 1/200 50
Элементы управления компенсацией
туба Антиген-флуорофор, добавляемый в шарики Концентрация запаса антител (мг / мл) Разведение антител Общий объем (мкл)
Непрозрачные бусы / / / 200
Одноцветные бусины CD11c 0.2 1/2000 200
Одиночные окрашенные бусины SiglecF 0.2 1/2000 200
Одиночные окрашенные бусины MHCII 0.2 1/200 200
Одиночные окрашенные бусины CD3 0.2 1/2000 200
Одиночные окрашенные бусины CD19 0.2 1/2000 200
Одиночные окрашенные бусины CD11b 0.2 1/400 200
Одиночные окрашенные бусины Ly6G 0.2 1/200 200

Таблица 2. Перечень элементов управления должны быть включены. В этой таблице представлены все необходимые элементы управления для точной интерпретации полученных результатов.

  1. Поверхность Окрашивание клеток
    Примечание: Это ImpoRtant, чтобы включить все критические контролы для анализа проточной цитометрии. Требуются три набора трубок (см. Таблицу 2 ): (1) пробирки, содержащие образцы; (2) пробирки с клетками BAL для каждого антитела-флуорофора для получения единичных пятен; Это позволяет определять напряжения для каждого канала на проточном цитометре; И (3) пробирки с шариками для каждого антитела-флуорофора для получения единичных пятен; Это необходимо для определения матрицы компенсации.
    1. Произведите смешивание антител и Fc-блока (анти-CD16 / CD32) в PBS в соответствующих разведениях (см. Таблицу 2 ). Необходимо определить оптимальное рабочее разбавление для каждого антитела перед экспериментом.
    2. Ресуспендируют клетки в 50 мкл смеси антител для образца и добавляют 50 мкл соответственно разбавленного антитела к критическим контрольным образцам.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Окрашивание может быть выполнено в 96-луночном, u-образном пластине. Это позволяет легко уменьшить объем пятен aго запуск значительного количества образцов.
    3. Инкубируют в течение 30 мин в темноте при 4 ° С.
    4. Центрифуга в течение 7 мин при 400 мкг и 4 ° С. Жидкость над осадком сливают.
    5. Повторное приостановить клетки в PBS до конечного объема 200 мкл.
      Примечание: Этот конечный объем зависит от минимального объема цитометр потока может получить доступ. Это может немного отличаться между машинами. Кроме того, объем считывания зависит от числа клеток и / или времени, когда образец будет принимать для запуска в проточном цитометре.
    6. Используйте образцы и элементы управления для анализа проточной цитометрии.
      Примечание: Для определения абсолютного количества клеток различных клеточных популяций, счетные шарики должны быть добавлены. Добавьте такое же количество шариков (± 25000) шариков для каждого образца непосредственно перед измерением. При использовании вперед и боковое рассеивание, считая шарики могут быть идентифицированы с помощью проточной цитометрии (см рисунок 1). Впоследствии, абсолютное количество клеток в образце можно рассчитать путем сравнения тысE отношение бортовых событий к событиям ячеек. Можно использовать следующую формулу:
      figure-protocol-13964
  2. Проточный цитометрический анализ
    ПРИМЕЧАНИЕ: проточный цитометрический анализ следует проводить сразу же после завершения протокола окрашивания. Необходимо использовать проточный цитометр с соответствующими лазерами и фильтрами для обнаружения сигнала. В таблице 3 представлен обзор лазеров и фильтров, необходимых для исследования, описанного в этой рукописи. Для получения дополнительной информации о проточном цитометрическом анализе см. Adan et al. 18 .
    1. Настройте первичные ворота на основе прямого и бокового разброса, исключая мусор и дублеты (см . Рис. 1 ).
    2. Отрегулируйте напряжение и компенсацию спектрального перекрытия с помощью однокрасочных клеток и шариков.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти настройки различны для каждого проточного цитометра, и их необходимо проверять перед каждым экспериментом. FИли правильного анализа потока, напряжения в прямом и боковом рассеянии являются критическими. Правильный прямой и боковой разброс может помочь в идентификации и подтверждении идентичности анализируемых клеток. Чтобы определить эти напряжения, сначала следует запустить образец без окраски.
    3. Настройте флуоресцентные вентили для поверхностного антигена (см . Рис. 1 ) и проанализируйте образцы.
Тип лазера Настройка фильтра
505 LP 525/50
Голубой (488 нм) 550 LP 575/26
100 мВт 670 л.с. 685/35
750 LP 780/60
Фиолетовый 405 нм 450/50
100 мВт
красный 633 нм 660/20
70 мВт 750 Л.П. 780/60

Таблица 3: Обзор лазеров и фильтры проточного цитометра , используемых в данном исследовании.

Результаты

После проведения БАЛ с 3х1 мл буферного солевого раствора необходимо восстановить объем между 2 и 3 мл. Эта жидкость БАЛ может быть дополнительно проанализирована для характеристики клеточного и неклеточного содержимого. Для исследования присутствия цитокинов и хемокинов могут быть выполнены ELISA 19 , иммуноблот 20 и одновременный анализ множественных цитокинов матрицей 21 цитокиновых гранул. Кроме того, альбумин и общее содержание белка в этой жидкости могут быть определены 22 .

В качестве примера, эта рукопись описывает, как анализировать клеточный состав жидкости БАЛ методом проточной цитометрии. Анализируемую жидкость БАЛ собирали у самок мышей Balb / cAnNCrl (возраст: 7 недель) через 24 ч после интратрахеальной инфильтрации липополисахаридом. Следующие антитела, связанные с флуорофором, wКоторые используются для идентификации различных типов клеток: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g и CD11b (см. Таблицу 1 и таблицу материалов ). Также применялся фиксируемый жизнеспособный краситель. Используя стратегию стробирования, основанную на дифференциальной экспрессии антигенов на поверхностях различных популяций клеток ( рис. 1 ), можно было идентифицировать макрофаги, дендритные клетки, В-клетки, Т-клетки, нейтрофилы и эозинофилы.

Во-первых, обломки и дублеты были отфильтрованы по параметрам прямого и бокового рассеяния. Жизнеспособный краситель облегчал стробирование на живых клетках. Затем идентифицировали высокие клетки CD11c и низкие клетки CD11c. В CD11c с высокой популяцией идентифицировали макрофаги и дендритные клетки на основе экспрессии MHCII и SiglecF, соответственно. В CD11c с низкой популяцией Т-клетки и В-клетки были идентифицированы на основе CD3ε и экспрессии CD19, соответственно. ВОстальная клеточная популяция, нейтрофилы и эозинофилы были идентифицированы на основе экспрессии CD11b и Ly-6G маркера, соответственно.

Подсчет шариков добавляли для определения абсолютных чисел клеток разных популяций клеток путем сравнения отношения событий шарика к событиям ячейки 23 . Эти счетные бусины были идентифицированы на основе их свойств прямого и бокового рассеивания ( рис. 1 ). В таблице 4 приведен обзор абсолютных чисел клеток разных популяций клеток в жидкости БАЛ наивной мыши и мыши, которую стимулировали в течение 24 ч с помощью 5 мкг липополисахарида.

figure-results-2820
Рисунок 1: Стратегия стробирования для проточной цитометрической детекции макрофагов, дендритных клеток, Т-клеток, В-клеток, нейтрофилов и эозинофиловN BAL Fluid. Клетки BAL выделяли с использованием описанного BAL-протокола. Клетки выделяли из мышей через 24 ч после интратрахеальной инстилляции липополисахарида. Подсчет шариков и ячеек был определен по свойствам прямого и бокового рассеяния. В клеточном вороте отдельные клетки идентифицировали с использованием прямого и бокового разброса. В этой последней популяции были идентифицированы клетки, которые были живыми. Затем идентифицировали высокие клетки CD11c и CD11c с низкими клетками. В CD11c с высокой популяцией идентифицировали макрофаги и дендритные клетки на основе экспрессии MHCII и SiglecF, соответственно. В CD11c с низкой популяцией Т-клетки и В-клетки были идентифицированы на основе CD3ε и экспрессии CD19, соответственно. В оставшейся популяции клеток нейтрофилы и эозинофилы были идентифицированы на основе экспрессии CD11b и Ly-6G, соответственно. Нажмите здесь, чтобы посмотретьБолее крупная версия этого рисунка.

Клеточная популяция Абсолютное число клеток у наивных мышей Абсолютное число клеток у LPS-стимулированных мышей
макрофаги 79612 25439
Дендритные клетки 495 671
Т-клетки 45271 28089
В-клетки 4164 2926
нейтрофилы 632 566716
эозинофилы 3483 4332

Таблица 4: ПредставлениеРезультаты анализа проточной цитометрии на BAL-жидкости наивных и LPS-стимулированных мышей.

Обсуждение

БАЛ является полезным методом получения цитологической и биохимической информации в ответ на инфекции или наркотики. Первоначально БАЛ использовался для управления чрезмерным выделением слизи у пациентов, страдающих токсичностью фосгена 3 . В настоящее время этот метод используется у людей для исследования патогенеза, диагностики и лечения заболеваний легких 3 , 24 . В лабораторных животных БАЛ обычно используется для мониторинга воспалительных реакций, иммунных механизмов и инфекционных процессов, которые происходят в легочных дыхательных путях 1 , 2 .

Для изучения воспалительного клеточного узора в моделях респираторных заболеваний БАЛ должен сопровождаться абсолютным и дифференциальным подсчетом клеток. В дополнение к абсолютному номеру ячейки также интересны относительные номера ячеек. Например, модели ремонта и рака показывают vКоличество клеток в клетках BAL увеличивается незначительно. В этой модели полезно оценить клеточный состав. Используя окраску клеток в сочетании с световой микроскопией, на основе морфологии 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 можно идентифицировать различные типы клеток, такие как эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты. Проточная цитометрия может использоваться для конкретных оценок, например для идентификации различных фенотипов Т-клеток 7 , 31 . В дополнение к идентификации различных популяций инфильтрирующих клеток, неклеточный состав легких можно исследовать с использованием БАЛ. Методы, такие как ELISA, иммуноблот, массив бусинок цитокинов, иммуногистохимия и количественная полимеразная цепная реакция выполняются на БАЛ-жидкости для определения цитокинов, ростаФакторов и других воспалительных компонентов. Для определения повреждения легких можно также измерить уровни общего белка и лактатдегидрогеназы в жидкости БАЛ 32 , 33 .

С развитием новых диагностических инструментов геномная и протеомная характеристика компонентов БАЛ станет возможной в ближайшем будущем. Сочетание расширяющихся вычислительных возможностей и высокопроизводительных технологий экспрессии генов позволит определить профили экспрессии определенных генов для различных болезненных состояний. Выполнение этих методик на БАЛ может обеспечить образцы экспрессии генов и белков, чтобы идентифицировать важные молекулы, вовлеченные в различные фазы легочных заболеваний.

Основным ограничением данных, полученных из жидкости БАЛ, является отсутствие сопоставимости между различными исследованиями 3 , 9 . Существует высокая степеньИзменчивость в технике лаважа и последующая обработка БАЛА. Чтобы иметь возможность сравнивать каждую пробу BAL, необходимо, чтобы стандартизировать тип промывной жидкости, который привил, сайт инстилляции, и фракцию, которая должна быть проанализирована для клеточного и не клеточного состава. Существует значительные различия в количестве лаважа фракций между различными испытаниями, колеблется от одного до 14 раз 34, 35, 36. Эта разница может оказать влияние на ожидаемую величину общего числа клеток в легких. Важно знать, какая BAL фракция жидкости содержит большинство клеток. Песни и др. показал , что примерно 70% от общего числа клеток были получены во фракции одного до трех 22. Тем не менее, другие сообщения о том , что второе промывание содержал больше клеток , чем первый 37, 38 . Мы можем сделать вывод из этих исследований, что промывание только одна фракции не представляет все легких, что приводит к неправильной интерпретации результатов.

Неклеточный состав жидкости BAL содержит ценную информацию о состоянии здоровья легких 33, 39, 40. Изменения в разведении БАЛА способствует разнице в квантификации растворимой фракции и, следовательно, к различиям в результатах между испытаниями. Песни и др. по сравнению с белками и лактата дегидрогеназы уровни каждой промывной фракции и пришли к выводу, что первая промывание фракция содержала два-три раза больше, чем во второй фракции.

Для того, чтобы получить репрезентативную выборку BAL для анализа, некоторые технические соображения имеют решающее значение. Один из них заключается в проведении надлежащего обезболивания. Это очень важно, чтобы проверить футовый рефЛекс мыши для обеспечения терминала седации. Это важно не только по этическим соображениям, но и потому, что трудно установить и сохранить катетер в правильном положении, если мышь не правильно наркозом.

Второй важный фактор является техническим положением катетера в трахее. Когда катетер вставлен слишком глубоко, это может привести к повреждению структуры легких. Дистальный конец катетера не должен достигать легких во время процедуры BAL. Катетер также должен быть стабилизирован и обвязывается с хлопчатобумажной нитью. Если катетер не стабилизируется, вводят физиологический раствор может течь вверх в полость носа, а не в легких. Во время инъекции и аспирации солевого раствора, важно, чтобы держать катетер устойчивым.

Данные, полученные из БАЛА должен представлять все мышиные легких. Поэтому важно , чтобы привить адекватный объем солевого буфера (т.е.3 мл, разделяли на 3 аликвоты по 1 мл каждый). Между выходом клеток и выходом жидкости BAL нет линейной зависимости. Важно аккуратно собирать раствор, массируя грудную клетку мыши. Если сдвигающие силы слишком сильны, жизнеспособность, функция и структура клеток в дыхательных путях и жидкости БАЛ могут быть скомпрометированы. Если аспирированная жидкость не видна в шприце, осторожно перемещайте катетер глубже или выше в трахее.

Особое внимание следует уделить конкретным аспектам обработки и анализа БАЛ. Это позволит максимизировать информацию, сохраненную в образцах BAL. После БАЛ клетки находятся в среде с низким содержанием питательных веществ в солевом растворе. Поэтому очень важно обрабатывать образцы в течение 1 часа после отбора проб БАЛ. Если требуется длительное хранение, требуется использование питательной среды.

Чтобы сохранить жизнеспособность клеток, избегайте труб, которые способствуют прилипанию клеток к поверхности. Избегать centrifugation клеточных суспензий на скоростях, которые могут поставить под угрозу целостности клеток или для предотвращения взмучивания равномерного считываемых клеток БАЛА. BAL жидкости, содержащей клетки должны быть центрифугировали при 400 х г и 4 ° С в течение 7 мин. Важно иметь в виду, что клеточные суспензии следует проводить при температуре 4 ° С во время обработки.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

LVH является научным сотрудником на кафедре биомедицинской молекулярной биологии университета Гента. ERJ поддерживается UniVacFlu, номер гранта 607690. KR поддерживается проектом EC-FP7 FLUNIVAC.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
balanced salt solutionThermo Fisher Scientific14175-129
ethyleendiaminetetra acetic acidSigma-AldrichE6511irritating
23G x 1 1/4 needleHenke Sass Wolf4710006030size: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neeldeHenke Sass Wolf4710004512size: 0,45*12 mm
plastic tubingBD medical technology427411Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023") O.D. .965 mm (0.38") 30.5m (100')
sodium pentobarbitalKela NV514
phosphate buffered salineLonzaBE17-516FPBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
1ml syringesHenke Sass Wolf5010.200V0non pyrogenic and non toxic
ForcepsFine Science Tools GmbH 91197-00
Surgical scissorsFine Science Tools GmbH 91460-11
centrifuge tube 50 mlTH.Geyer7696705Free from Rnase/Dnase/endotoxin
centrifuge tube 15 mlTH.Geyer7696702Free from Rnase/Dnase/endotoxin
microcentrifuge tube 1,5 mlSigma-Aldrich0030 120.094polypropylene
MicrocentrifugeSigma-Aldrich5415R
CentrifugeThermo Fisher Scientific75004030
ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing bufferLonza10-548Esterile filtered
live/dead -efluor506ebioscience65-0866-18  fixable viability dye
CD11c-PE-cy7eBiosciences25-0114-81
SiglecF-PEBD Pharmingen 552126 
MHCII-APCefluor780Biolegend107628 
CD3-PE-cy5VWR55-0031-U100 
CD19-PE-cy5eBiosciences15-0193-83 
CD11b-V450BD Pharmingen 560455 
Ly6G-AF700Biolegend127621
Absolute Counting BeadsLife Technologies Europe B.V. C36950
anti-CD16/CD32BD Pharmingen553142
96-well 340 µl storage plate plateFalcon353263V-bottom, natural polypropylene
flow cytometerBD Biosciences
catheterBD Biosciences393202

Ссылки

  1. Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
  2. Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
  3. Gee, J. B., Fick, R. B. Bronchoalveolar lavage. Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).
  4. Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
  5. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, 155-159 (2005).
  6. Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38 (2016).
  7. Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
  8. Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
  9. Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
  10. Baughman, R. P. The uncertainties of bronchoalveolar lavage. Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).
  11. Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
  12. Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
  13. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  14. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  15. Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
  16. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
  17. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105 (2013).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
  22. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
  23. Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
  24. Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
  25. Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
  26. Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91 (2005).
  27. Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
  28. Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
  29. Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
  30. Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
  31. Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
  32. Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
  33. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
  34. Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
  35. Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
  36. Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
  37. Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
  38. Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
  39. Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
  40. Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены