Эксперименты ямР высокого давления для обнаружения белковых низколежащих конформационных состояний

Резюме

Мы предоставляем подробное описание этапов, необходимых для сборки ячейки высокого давления, настройки и записи экспериментов с ЯМР высокого давления и, наконец, анализа как пиковой интенсивности, так и изменений химического сдвига под давлением. Эти эксперименты могут дать ценную информацию о путях сворачивания и структурной стабильности белков.

Аннотация

Высокое давление является хорошо известным методом возмущения, который может быть использован для дестабилизации глобулярных белков и диссоциации белковых комплексов обратимым образом. Гидростатическое давление приводит термодинамическое равновесие к состоянию (состояниям) с меньшим молярным объемом. Таким образом, повышение давления дает возможность точно настроить стабильность глобулярных белков и равновесия олигомеризации белковых комплексов. Эксперименты с ЯМР высокого давления позволяют детально охарактеризовать факторы, управляющие стабильностью глобулярных белков, механизмы их сворачивания и механизмы олигомеризации, сочетая способность тонкой настройки стабильности возмущения давлением и разрешение сайта, предлагаемое растворной ЯМР-спектроскопией. Здесь мы представляем протокол для исследования локальной стабильности сворачивания белка с помощью набора экспериментов 2D 1H-15N, записанных от 1 бар до 2,5 кбар. Шаги, необходимые для получения и анализа таких экспериментов, иллюстрируются данными, полученными по домену RRM2 hnRNPA1.

Введение

Давно признано, что высокоэнергетические, малонаселенные конформационные состояния белков и белковых комплексов играют ключевую роль во многих биологических путях^1,2,3. Благодаря экспериментам, основанным на последовательностях импульсов Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG)^4,переноса насыщения химического обмена (CEST)⁵и переноса^{насыщения} обмена в темном состоянии (DEST) 6 (среди прочих), раствор ЯМР-спектроскопии появился в качестве метода выбора для характеристики переходных конформационных состояний^7. Наряду с этими экспериментами могут быть введены возмущения, такие как температура, рН или химические денатуранты, чтобы увеличить относительную популяцию конформационных субсостояний с более высокой энергией. Аналогичным образом, белковые равновесия также могут быть возмущены применением высокого гидростатического давления. В зависимости от величины изменения объема, связанного с соответствующими конформационными изменениями, увеличение давления на несколько сотен до нескольких тысяч бар может значительно стабилизировать более высокое энергетическое состояние или привести к полному раскрытию белка^{на 8,9,10.} Спектры ЯМР белка обычно отображают два типа изменений с гидростатическим давлением: (i) изменения химического сдвига и (ii) изменения пиковой интенсивности. Изменения химического сдвига отражают изменения на границе раздела белка с поверхностью воды и/или локальное сжатие структуры белка в быстрой шкале времени (относительно шкалы времени ЯМР)^11. Поперечные спицы, демонстрирующие большие нелинейные химические сдвиги зависимости давления, могут указывать на наличие более высоких энергетических конформационных состояний^12,13. С другой стороны, изменения пиковой интенсивности указывают на крупные конформационные переходы в медленной шкале времени, такие как изменения в сложенных / развернутых популяциях состояний. Наличие складчатых промежуточных продуктов или более высоких энергетических состояний может быть обнаружено по большим вариациям величины изменения объема при развертывании, измеренному для различных остатков данного белка^14,15,16,17. Основываясь на нашем опыте, даже небольшие белки, которые обычно классифицируются как папки с двумя состояниями, демонстрируют неоднородные реакции на давление, что дает полезную информацию об их локальной стабильности сворачивания. Здесь описан протокол получения и анализа зависимости от амидных пиковых и химических сдвигов ¹H, использующих в качестве модели белка изолированный мотив распознавания РНК 2 (RRM2) гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1 (hnRNPA1).

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, требует (i) насоса высокого давления и ячейки с алюминиевой закаленной циркониевой трубкой 2,5 кбар^18,(ii) программного обеспечения SPARKY¹⁹ для анализа спектров ЯМР и (iii) программного обеспечения для установки кривых.

1. Пробоподготовка, сборка ячейки высокого давления и постановка экспериментов.

1. Выбор буфера: Используйте равную смесь анионных и катионных буферов, таких как фосфат и Tris^20,21.
   ПРИМЕЧАНИЕ: pKa арионных буферов, таких как фосфат и MES, связан со значительным реакционным объемом (т.е. разницей в частичных моляных объемах кислоты и ионизированных продуктов). Таким образом, на рН таких буферов может существенно повлиять изменение давления (~0,25-0,5 рН единицы/кбар).
2. Убедитесь, что требуемый объем образца аналогичен объему стандартной ЯМР-трубки диаметром 3 мм (~300 мкл).
3. Введите образец с маркировкой ¹⁵N со стеклянной пипеткой в циркониевые трубки. Убедитесь, что образец сидит в нижней части трубки. В комплекте с 200 мкл минерального масла для предотвращения смешивания образца с трансмиссионной жидкостью (например, водой). Заполните остальную часть трубки трансмиссионной жидкостью.
4. Поместите одноразовое уплотнительное кольцо поверх циркониевой трубки и вставьте трубку в основание(рисунок 1A,B). Затем подключите трубку к линии троса высокого давления и затяните основание к ячейке сначала вручную. Затем примените 14,7 Нм крутящего момента для предотвращения утечек при более низком давлении(рисунок 1C,D).
5. Чтобы проверить целостность ячейки давления в сборе, нажмите трубку до 300 бар вне спектрометра с помощью поддержки ячейки и защитного сосуда. Подождите 15 минут, сбросьте давление до 1 бар и проверьте наличие утечек чистой безворсовой салфеткой.
6. Вставьте трубку без давления в спектрометр, осторожно направляя линию троса. Сдвиньте трубку в спектрометр до тех пор, пока не достигнете сидячего положенияобразца (рисунок 1Е).
7. Как обычно, блокируйте, сжимайте, сопоставляйте и настраивайте каналы ¹H и ¹⁵N.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прокладки для циркониевых трубок высокого давления сильно отличаются от стандартных ЯМР-трубок. Рекомендуется сохранить оптимизированные прокладки для дальнейшего использования.
8. Установите ^1H-15N-HSQC или TROSY-HSQC и запишите эталонный эксперимент в атмосферных условиях (1 бар).

2. Запись экспериментов с ЯМР высокого давления

1. Постепенно увеличивайте давление с 1 бар до 2,5 кбар с шагом 500 бар, чтобы проверить общую стабильность белка. Установите скорость напорного насоса по умолчанию на ~18 бар/с. Если точные скорости складывания/разворачивания неизвестны, пусть образец уравновешивается через 15-20 минут после каждого 500-барного приращения. Запись спектра при 2,5 кбар.
2. Постепенно снижайте давление обратно до 1 бар с шагом 500 бар, чтобы проверить обратимость возмущения давления. Запишите другой спектр в атмосферных условиях и сравните химические сдвиги и пиковые интенсивности с этим спектром, ранее зарегистрированным в тех же условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нативные поперечные поперечные трубы более интенсивны после пробега давления, это может указывать на то, что мелкие агрегаты, присутствующие в растворе при атмосферном давлении, могут диссоциировать и правильно сворачиваться. С другой стороны, потеря интенсивности или значительные изменения химического сдвига предполагают, что белок может испытывать необратимое неправильное сворачивание в условиях высокого давления.
3. Запишите серию 2D-экспериментов от 1 бар до 2,5 кбар каждые 500 бар. Рекомендуется записывать дополнительные эксперименты вблизи точки перегиба перехода складывания/разворачивания для повышения точности подгонки.

3. Анализ изменений пиковой интенсивности

1. Обработайте все спектры и перенесите основное назначение из опорного спектра при 1 бар в спектр, записанный при 500 бар, а затем перенесите назначение с 500 бар на 1 кбар и так далее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку давление вызывает неравномерный сдвиг химических сдвигов ^{на 1}Н и ¹⁵Н, не следует просто копировать распределение магистрали из одного спектра в другой. Отрегулируйте его вручную.
2. В меню Sparky выберите Пик > ПикОвый список (lt). В окне «Список пиков» нажмите «Параметры» и выберите параметр для отображения частот (ppm) и высоты данных. Сохраните список, полученный для каждого спектра.
3. В программном обеспечении для подгонки кривых скопируйте идентификатор крестообразного и пикового значения интенсивности, чтобы значения давления (в барах) были переменной оси X, а интенсивность — переменной оси Y.
4. Если наблюдается полное или почти полное (>80%) развертывание, подготовьте отдельные профили пиковой интенсивности для извлечения свободной энергии и изменения объема при развертывании, соответственно, используя простую модель двух состояний:
   Экв. 1
   Где «I» — наблюдаемая интенсивность поперечного скрипа при заданном давлении p, а I_F — интенсивность одного и того же кросспика в полностью сложенном состоянии. R — газовая постоянная, T — абсолютная температура, ΔG_U⁰ — стандартная разность свободной энергии Гиббса между развернутым и сложенным состояниями при атмосферном давлении p₀ (1 бар) и ΔV_u изменение объема при разворачивании. При давлении p в баре и температуре T в кельвинах R = 1,987 кал/К, ΔG_U⁰ в кал/моль, а ΔV_U в кал/моль/бар. Умножьте значения ΔV_U, полученные из прилега, на 41,84 для преобразования в мл/моль. Значения ΔV_U обычно находятся в диапазоне от -50 до -150 мл/моль для глобулярных белков^22. Здесь все параметры выражены относительно разворачивающейся реакции, но могут быть легко преобразованы в параметры реакции складывания (ΔG_U⁰ = -ΔG_F⁰ и ΔV_U = -ΔV_F).

4. Анализ изменений химического сдвига

1. Расположите столбцы в программном обеспечении таким образом, чтобы точки давления были переменными, а химические сдвиги ¹H, извлеченные из списков Sparky, были осью Y.
2. Уложить зависимость давления химических сдвигов ¹H к простому квадратичному уравнению:
   δ(p) = δ₀(p₀) + B₁(p-p₀) + B₂ (p-p₀)² экв. 2
   Где,δ(p)- измеренный ^{химический}сдвиг поперечного поперечного δ₀(p₀₎ ¹H химических сдвигов того же поперечного спектра в опорном спектре, зарегистрированных при 1 баре. B₁ и B₂ представляют параметры первого и второго порядка, выраженные в ppm/bar и ppm/bar²соответственно.

Результаты

Описанный здесь протокол был использован для исследования зависимости давления RRM2, второго мотива распознавания РНК hnRNPA1 (остатки 95-106), который почти полностью развернут в диапазоне 2,5 кбар (>90%). ^{1 1} Спектры^H-15N были собраны при 1 бар, 500 бар, 750 бар, 1 кбар, 1,5 кбар, 2 кбар и 2,5 кбар

Обсуждение

В этом исследовании подробно описывается протокол, реализованный для исследования структурных и термодинамических реакций белка на возмущение давления. Эксперименты с высоким давлением, записанные здесь на RRM2, демонстрируют, что большие вариации значений ΔV_U, свидетельствующие...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar	Daedalus Innovations LLC	NMRCELL-B
Sparky3	University of California San Francisco, CA	N/A
Xtreme-60 Syringe pump	Daedalus Innovations LLC	XTREME-60