Характеристика сальмонеллы Typhimurium-индуцированного септического перитонита у мышей

Резюме

Этот протокол описывает индукцию грамотрицательного монобактериального сепсиса в мышиной модельной системе. Модель полезна для исследования воспалительных и смертельных реакций хозяина во время сепсиса.

Аннотация

Сепсис представляет собой нерегулируемый иммунный ответ хозяина на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органов в месте, удаленном от инфекции или повреждения. В настоящее время широко используемые модели сепсиса на мышах включают липополисахаридную (LPS) эндотоксемию, лигирование и пункцию слепой кишки (CLP) и модельные системы монобактериальных инфекций. Этот протокол описывает метод изучения реакций хозяина во время сальмонеллы Typhimurium, вызванного инфекцией септического перитонита у мышей. С. Typhimurium, грамотрицательный внутриклеточный патоген, вызывает брюшной тифоз у мышей.

Этот протокол разрабатывает культуральную подготовку, индукцию септического перитонита у мышей посредством внутрибрюшинной инъекции и методы изучения системных реакций хозяина. Кроме того, представлена оценка бактериальной нагрузки в различных органах и проточный цитометрический анализ повышенного количества нейтрофилов в перитонеальном лаваже. Сальмонелла Typhimurium-индуцированный сепсис у мышей приводит к увеличению провоспалительных цитокинов и быстрой инфильтрации нейтрофилов в брюшинной полости, что приводит к снижению выживаемости.

Каждый шаг в этом протоколе был оптимизирован, что привело к высокой воспроизводимости патогенеза септического перитонита. Эта модель полезна для изучения иммунологических реакций во время бактериального сепсиса, роли различных генов в прогрессировании заболевания и эффектов лекарств для ослабления сепсиса.

Введение

Сепсис определяется как дисрегулируемый системный воспалительный и иммунный ответ на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органа, удаленному от места инфекции или повреждения. Септический шок представляет собой подмножество сепсиса, характеризующегося гипотонией, сохраняющейся во время объемной реанимации, со значительно повышенным риском смертности¹. Широкая общественность стала более осведомлена об этом расстройстве во время пандемии COVID-19. Несмотря на высокую смертность, всеобъемлющие эпидемиологические данные о глобальном бремени сепсиса отсутствуют из-за сложности его диагностики. В 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, что составляет 19,7% всех глобальных смертей². Кроме того, исследование расширенной распространенности инфекции и связанного с ней сепсиса у пациентов отделения интенсивной терапии показало, что 62% положительных изолятов от пациентов были грамотрицательными организмами³.

Первоначально исследования сепсиса были сосредоточены на разграничении микробного патогенеза. Однако понимание «гипотезы опасности», которая диктует, как хозяин различает себя и не-себя, привело к смещению баланса исследований сепсиса в сторону понимания реакции хозяина на вторгшийся патоген. Широко используемые модели сепсиса на мышах включают модель эндотоксемии, индуцированную липополисахаридом (ЛПС), модели полимикробного сепсиса, перевязку и пункцию слепой кишки (CLP) и перитонит стента толстой кишки (CASP) и модели монобактериальной инфекции⁴.

Мы стандартизировали систему мышиной модели, индуцируя перитонеальный сепсис с использованием Salmonella Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, потому что Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном, который имитирует клинически значимое состояние грамотрицательного сепсиса. Исход сепсиса перитонита в этой модели является системным, со 100% смертностью в течение 96 ч после заражения. Таким образом, эта модель играет важную роль в изучении воспалительных и смертельных реакций хозяина. В этой модели сепсис индуцируется внутрибрюшинной инъекцией 0,5 миллиона колониеобразующих единиц (КОЕ) Salmonella Typhimurium в 8-10-недельную мышь C57BL/6. Системная инфекция может быть подтверждена путем оценки бактериальной нагрузки органов ~ 16 ч после заражения. Эта статья демонстрирует сепсис перитонита, вызванный сальмонеллой Typhimurium, у мышей, характеризует результирующие изменения в составе перитонеальных клеток и количественно оценивает бактериальную нагрузку в различных органах.

протокол

Все эксперименты с использованием Salmonella Typhimurium проводились на объектах уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Необходимо соблюдать осторожность при использовании надлежащих средств индивидуальной защиты (СИЗ), обеспечивать безопасность и следовать стандартным методам утилизации биологической опасности BSL-2. Все эксперименты на мышах проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по этике животных, IISc. Мыши были выведены и содержались в Центральном животноводческом учреждении IISc (регистрационный номер: 48/1999/CPCSEA, от 03.01.1999), утвержденном Министерством окружающей среды и лесного хозяйства правительства Индии. Протоколы экспериментов были утверждены Комитетом по целям, контролю и надзору за экспериментами на животных с утвержденным номером разрешения CAF/Ethics/797/2020.

Определение BSL2: Рейтинг BSL2 представляет собой то, что биологически опасные агенты представляют умеренную угрозу для окружающей среды и лабораторного персонала⁵.

1. Приготовление культуры сальмонеллы Typhimurium         

1. Добавьте 100 мкл бульона сальмонеллы Typhimurium NCTC 12023 глицерина в 3 мл бульона Luria Bertani (LB). Инкубируйте культуру со скоростью 160 об/мин при 37 °C в течение ночи.
2. Проведите 50 мкл выращенной на ночь культуры в бульоне LB на агаровую пластину Salmonella Shigella (SS) и инкубируйте при 37 °C в течение ~ 12 ч. Храните агаровую пластину SS с бактериальными колониями при 4 °C в течение нескольких дней до эксперимента с инфекцией in vivo .
3. Выберите одну колонию из полосатой агаровой пластины SS с помощью микроконверса. Выталкивайте микрокол в 3 мл бульона LB и культивируйте при 160 об/мин при 37 °C в течение ночи.
4. Добавьте 0,1 мл бактериальной культуры к 50 мл бульона LB и инкубируйте при 37 °C в шейкерном инкубаторе при 160 об/мин в течение 3-4 ч, чтобы достичь логарифмической фазы роста. Разбавить культуру в 2 раза, используя бульон LB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время логарифмической фазы бактериальные клетки находятся в лучшем состоянии здоровья и активно делятся.
5. Измерьте оптическую плотность (OD) культуры при длине волны света 600 нм в спектрофотометре или считывателе микропластин. Как только ОД достигнет 1,0, сделайте две аликвоты по 1 мл культуры в микрофьюжных пробирках объемом 1,5 мл.
6. Центрифугируйте пробирки по 7 750 × г в течение 15 мин. Выбросьте супернатант и промыть гранулу 1 мл 1x PBS 2x. Центрифугируйте пробирки по 7 750 × г в течение 15 мин.
7. Повторно суспендировать гранулу в 0,5 мл 1x PBS в двух разных микрофьюжных пробирках по 1,5 мл. Объедините суспензии из обеих трубок в одну трубку объемом 1,5 мл, содержащую ~ 2 × 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.
8. Приготовьте бактериальную клеточную суспензию 1 × 10⁶ КОЕ/мл, разбавляя этот раствор.
   ВНИМАНИЕ: Оптимизируйте КОЕ, соответствующую OD, в определенных лабораторных условиях для определения КОЕ для OD 1.0 перед началом экспериментов.

2. Мыши и инфекции

1. Домашний 8-10-недельный самец мышей C57BL/6 весом ~20 г в помещении для животных в течение нескольких дней для акклиматизации.
2. В день заражения подержите мышь одной рукой, протрите кожу живота 70% этанолом, а задние лапы раздвиньте для лучшей доступности брюшной стенки.
3. Вводят 0,5 мл 1 × 10⁶ КОЕ/мл бактериальной суспензии внутрибрюшинно с помощью шприца 1 мл. Поэтому каждая мышь получает 5 × 10⁵ КОЕ. Контрольные, неинфицированные мыши получают 0,5 мл PBS в одиночку. После заражения вдавайте культуру, чтобы проверить фактически введенный КОЕ, который может варьироваться от 0,2-0,8 млн КОЕ / 0,5 млн.
4. Поместите мышей обратно в клетки по назначению.
5. Принесите в жертву мышей, использующих асфиксию_CO2 ~ 12-18 ч после заражения, для лучшего ответа. Обычно все инфицированные мыши умирают в течение 96 ч. При некоторых экспериментальных вмешательствах некоторые мыши могут выжить. Усыпляют этих мышей через 96 ч. Кроме того, усыпляют любую мышь с температурой тела ниже 33,2 ° C и острым дистрессом через 96 ч в качестве гуманной конечной точки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой модели некоторые мыши могут начать умирать после 12 ч инъекции сальмонеллы . Поэтому планируйте эксперименты правильно, используя несколько временных точек.

3. Оценка КОЕ органов

1. Принесите в жертву инфицированную мышь удушьем_CO2 и протрите живот кусочком хлопка, смоченным в 70% этаноле. Разрезать кожу живота. Обратитесь к статье Рэя и Диттеля для видеопротокола о том, как собирать жидкость для промывания брюшины⁶. Вскрываем брюшинную полость и собираем органы, представляющие интерес, в микрофьюжные трубки. Кроме того, поскольку кровь у мышей с сепсисом быстро свертывается, а количество низкое, соберите ее быстро после жертвоприношения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это видео демонстрирует перечисление КОЕ органов из печени, поскольку печень подвергается обширному гистопатологическому повреждению в этой модели сепсиса.
2. Отрежьте небольшой кусочек печени и поместите его в микрофьюжную трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Его можно хранить на льду в течение максимум 2-3 ч, прежде чем перейти к следующему шагу.
3. Взвесьте и переложите кусочки в микроцентрифужные трубки. Предпочтительно нарезать куски массой ~10-15 мг для правильной гомогенизации. Используйте целые органы в случае более мелких, таких как брыжеечные лимфатические узлы (MLN) или тимус.
4. Добавьте в трубку 0,5 мл 1x PBS и гомогенизируйте органы с помощью гомогенизатора рук. Убедитесь, что органы полностью гомогенизированы. Увеличьте объем до 1 мл, добавив 0,5 мл 1x PBS.
5. Центрифугируйте пробирки по 200 × г в течение 5 мин при 4 °C.
6. Соберите супернатант в свежие микрофрагменные трубки и приготовьте разведения 1 × 10⁻¹ и 10⁻² в 96-луночной пластине.
7. Выложить 50 мкл разбавителя на свежие агаровые пластины SS и инкубировать пластины при 37 °C в течение 12 ч.
8. Подсчитайте количество колоний, которые появляются в каждом состоянии, и нормализуйте данные с массой органа с помощью уравнения (1):
   КОЕ/мг = (1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Число 20 используется в формуле для преобразования колоний на пластину в КОЕ/мл. Это число получают путем деления 1 мл на количество данного объема покрываемой культуры - в данном случае 50 мкл.
   Например, если в агаровой пластине SS обнаружено 100 колоний, где распространяется 50 мкл 1 × ^10-1 разведения гомогенизированного органа весом 10 мг, то
   КОЕ/мг =

4. Проточный цитометрический анализ различных популяций иммунных клеток в перитонеальном экссудате

1. Соберите перитонеальные клетки, как описано ранее Ray и Dittel⁶.
2. Повторное суспендирование клеточной гранулы из жидкости перитонеального лаважа в 1 мл RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Перечислите общее количество клеток в промывании брюшины с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте количество клеток так, чтобы каждая трубка получала 0,2-0,5 миллиона клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перитонеальное лаваж у мышей с сепсисом может содержать эритроциты, которые, вероятно, появляются из-за кровоизлияния. Будьте осторожны, чтобы исключить эритроциты при подсчете перитонеальных клеток. В микроскопе С ярким полем эритроциты кажутся намного меньше, чем иммунные клетки. Они выглядят как плоские диски или пончики, круглые, с углублением в центре, но не полые. Шаг для лизирования эритроцитов может быть добавлен⁷.
3. Раскрутите ячейки вниз при 200 × g при 4 °C в течение 10 мин, выбросьте супернатант и промыте ячейки 1x с 1x холодным PBS. Центрифугирование клеток при 200 × г при 4 °C в течение 10 мин.
4. Блокируют Fc-рецепторы на PECs с помощью блокатора FcR (разбавление 1:400), приготовленного в блокирующем буфере, состоящем из 5% FBS и 0,02% азида натрия в PBS. Инкубировать на льду в течение 15 мин.
5. Центрифугируют ячейки при 200 × г при 4 °C в течение 10 мин. Выбросьте супернатант. Разбавляют фторхром-конъюгированные антитела, представляющие интерес в блокирующем буфере. Используйте разведение 1:500 против мышиного LY6G для окрашивания нейтрофилов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие популяции иммунных клеток также могут быть обнаружены с помощью, например, антимышечного B220 для В-клеток, антимышечного CD3 для Т-клеток и антимышечного F4/80 для макрофагов.
6. Инкубируют ~0,2 млн клеток в 200 мкл разбавленных растворов антител в отдельных пробирках. В качестве отрицательного контроля выделяют по одной трубке в каждом типе фторхрома для неокрашенного контроля для инкубации клеток с 200 мкл блокирующего буфера без антител.
7. Инкубируйте образцы на льду в течение 45 минут с прерывистым постукиванием каждые 15 минут.
8. Центрифугируют ячейки при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в течение ~ 15 мин при комнатной температуре, если их необходимо хранить в течение нескольких дней. Однако лучше всего получать данные из свежеокрашенных образцов в проточном цитометре.
9. Повторное суспендирование клеток в 200 мкл буфера окрашивания FACS (2% FBS в PBS). Получение данных в проточном цитометре.

Результаты

Подробная характеристика иммунного ответа хозяина с использованием этой конкретной модели показана в предыдущих публикациях ^8,9. В этом разделе представлены некоторые репрезентативные результаты описанного протокола. Эта модель направлена на индуциро...

Обсуждение

В данной статье описан метод индуцирования тяжелой формы бактериального сепсиса путем внутрибрюшинной инъекции сальмонеллы Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, так как Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном и, следовательно, высокопатогенным, имитируя клиниче...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
1 mL Sterile Syringe with 26 G needle	Beckton Dickinson, Singapore	303060
1.5 mL Microcentrifuge Tube	Tarsons, USA	500010
10 mL Sterile Syringe with 21 G needle	Beckton Dickinson, Spain	307758
50 mL Conical Flask	Tarsons, USA	441150
50 mL Graduated Centrifuge Tube	Tarsons, USA	546041
50 mL Graduated Centrifuge Tube	Tarsons, USA	546021
Cell spreader	VWR, USA	VWRU60828-680
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	HiMedia, Mumbai, India	TS1006
Ethanol	Merck	100983
FcR blocker	BD Biosciences	553142
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551460
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hand based Homogenizer	-	-
Hemocytometer (Neubauer counting chamber)	Rohem, India	I.S. 10269
Luria Bertani Broth	HiMedia, Mumbai, India	M1245
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petriplates	Tarsons, USA	460091
RPMI	Himedia, Mumbai, India	AT060-10X1L
Salmonella-Shigella Agar	HiMedia, Mumbai, India	M108
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Equipments
Centrifuge	Kubota
Flow cytometer	BD FACSverse
Incubator	N-biotek
Spectrophotometer	Shimadzu
Weighing machine	Sartorius