Удаленный сбор данных криоэлектронной томографии и усреднение субтомограмм

Резюме

Настоящий протокол описывает удаленный сбор данных криоэлектронной томографии высокого разрешения с использованием Tomo5 и последующую обработку данных и усреднение субтомограмм с использованием emClarity. Апоферритин используется в качестве примера для иллюстрации подробных пошаговых процессов для достижения крио-ET структуры с разрешением 2,86 Å.

Аннотация

Криоэлектронная томография (крио-ET) набирает обороты в последние годы, особенно с момента внедрения прямых электронных детекторов, улучшенных автоматизированных стратегий сбора, подготовительных методов, которые расширяют возможности того, что электронный микроскоп может изобразить с высоким разрешением с использованием крио-ET и нового программного обеспечения для усреднения субтомограмм. Кроме того, сбор данных становится все более упорядоченным, что делает его более доступным для многих пользователей. Пандемия SARS-CoV-2 еще больше ускорила сбор данных дистанционной криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), особенно для крио-ЭМ с одной частицей, во многих учреждениях по всему миру, обеспечив непрерывный доступ пользователей к самым современным приборам во время пандемии. Благодаря недавним достижениям в Tomo5 (программное обеспечение для 3D-электронной томографии), удаленный сбор крио-ET данных стал надежным и простым в обращении из любой точки мира. Эта статья призвана предоставить подробное пошаговое руководство, начиная с настройки сбора данных в программном обеспечении томографии для процесса (удаленного) сеанса сбора крио-ET данных с подробным устранением неполадок. (Удаленный) протокол сбора данных дополнительно дополняется рабочим процессом определения структуры при почти атомарном разрешении путем усреднения субтомограммы с emClarity, используя в качестве примера апоферритин.

Введение

Широко известно, что криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) пережила период возрождения, ускорив ее, чтобы стать основным и центрально полезным инструментом в структурной биологии. Разработка и использование детекторов прямых электронов ^1,2,3, улучшенных микроскопов и источников электронов ^3,4,5, улучшение автоматизации/пропускной способности 6,7,8,9 и вычислительные достижения в анализе одной ^{частицы} 10,11,12,13 ^,14 и томография 15,16,17 частично ответственны за недавний успех методики. Эти технологические драйверы развили способность крио-ЭМ решать биологические макромолекулярные структуры в криогенных и нативных условиях. Легкодоступные разрешения достаточны для атомарно точного моделирования и вывели эту технику на передний план структурной биологии. Редукционистский подход к выражению и очистке биологической мишени, представляющей интерес, уже давно доказал свою успешность в макромолекулярной кристаллографии (MX) для фундаментальных биологических исследований, открытия лекарств и трансляционной науки. При том же подходе крио-ЭМ теперь может давать результаты, параллельные исследованиям MX с высоким разрешением. Текущий крупный успех в крио-ЭМ-отрасли структурной биологии называется анализом одиночных частиц (SPA), который получает 2D-проекционные изображения, как правило, очищенного образца белка¹⁸ для получения тысяч видов биологической макромолекулы¹⁹. Эти изображения (1) содержат информацию из диапазона видов, которые полностью представляют ориентации цели в 3D-пространстве и (2) фиксируют конформационную гетерогенность объекта, которая впоследствии может быть отделена и исследована.

Альтернативным подходом к получению этих 2D-проекционных изображений биологических образцов, даже in situ и без очистки, является криоэлектронная томография (крио-ET). Cryo-ET делает серию изображений одного и того же объекта под наклонными углами, механически вращая образец. Таким образом, 2D-проекции, собранные в SPA, представляющие угловые позы интересующей молекулы, по своей сути собираются в рамках эксперимента крио-ET визуализации²⁰. Затем томографические наклонные ряды реконструируются в томограмму, которая содержит 3D-представления изображенных макромолекулярных комплексов. Характер сбора томографических данных в некоторой степени снижает зависимость от усреднения для достижения полного 3D-представления молекулы из коллекции 2D-изображений. Однако из-за современных конструкций стадии образец обычно наклоняется от −60° до +60°, оставляя недостающий клин²¹ информации в томографической 3D-реконструкции.

3D-реконструкции в одной томограмме затем имеют недостающий клин информации и низкий уровень сигнала к шуму. Отдельные макромолекулы могут быть извлечены в виде субтомограмм и усреднены вместе для решения этой проблемы. Там, где каждая макромолекула в субтомограмме находится в разной ориентации, отсутствующий клин ориентирован по-разному в каждой субтомограмме целевого объекта, поэтому усреднение по многим копиям заполняет информацию из-за отсутствующего клина. Последние разработки в области обработки изображений также пытались обучить нейронные сети искусственного интеллекта заполнять недостающий клин значимыми данными²². Этот процесс усреднения также увеличивает сигнал к шуму, сродни цели усреднения в анализе отдельных частиц, поэтому качество и разрешение реконструкции улучшаются. Если интересующая молекула обладает симметрией, она также может быть определена и использована во время усреднения, что еще больше улучшает разрешение реконструкции. Извлечение 3D-объемов макромолекулы из томограммы в набор субтомограмм и их последующая обработка известна как усреднение субтомограммы (STA)²³. Если каждая субтомограмма представляет собой уникальную копию изучаемой молекулы, любая структурная гетерогенность может быть опрошена с использованием рабочего процесса STA. Как обычно используется в рабочем процессе SPA, методы классификации могут быть использованы во время STA для анализа конформационных состояний интересующего комплекса. Помимо STA, обеспечивающего реконструкцию с высоким разрешением в крио-ET, этот подход делает технику мощным инструментом для опроса структурных механизмов макромолекул в их родной клеточной среде или мишеней, часто не поддающихся SPA 24,25,26.

Электронная томография имеет долгую историю определения 3D ультраструктуры клеточных образцов при комнатной температуре²⁷. Получение изображений путем физического наклона образца обеспечивает достаточную информацию для 3D-реконструкции объекта в масштабах клеточной длины и особенно важно, когда клеточным структурам не хватает регулярности для усреднения. Клетки также могут быть заморожены на подложках для крио-ET визуализации на краях клеток, где образец достаточно тонкий, чтобы быть электронным прозрачным. В этих условиях STA может быть использован для определения макромолекулярных структур в клеточной среде, хотя и когда образец достаточно тонкий, чтобы быть электронным прозрачным²⁸. Однако в сочетании с дополнительными препаративными методами, включая криокоррелятивную световую и электронную микроскопию (крио-CLEM) и фрезерование сфокусированного ионного пучка (крио-FIB), крио-ET может быть использован для изображения внутри целых клеток в криогенных условиях²⁹. Это объединяет возможности крио-ИНОПЛАНЕТЯН для изучения клеточной ультраструктуры со способностью STA определять структуры макромолекулярных комплексов in situ , идентифицируя их клеточное местоположение³⁰ и предоставляя снимки комплексов, участвующих в динамических процессах³¹. Способность метода визуализировать клеточные образцы и использовать STA в нескольких исследованиях подчеркнула силу метода для решения макромолекулярных структур in situ, даже при разрешениях, сопоставимых с SPA³². Еще одно преимущество обнаруживается в знании исходного местоположения макромолекулы, представленной окончательной засекреченной 3D-реконструкцией на томограмме³⁰. Поэтому макромолекулярную структуру можно соотнести с клеточной ультраструктурой. Эти наблюдения по масштабам длины, по-видимому, приведут к важным выводам, где структурные механизмы могут быть коррелированы с клеточными изменениями в контексте функциональных исследований.

Cryo-ET и STA позволяют собирать данные в трех основных рабочих процессах: молекулярной, клеточной и ламельной томографии. Структуры очищенных высокомолекулярных комплексов могут быть определены с помощью крио-ЭТ методом молекулярной томографии. Определение белковых структур в их клеточной среде, где клетка достаточно тонкая, может быть описано как клеточная томография. Совсем недавно, с развитием криогенного таргетирования и измельчения, эти же методы могут быть применены в рабочих процессах ламельной томографии для определения белковых структур глубоко внутри клетки в их родной среде, выявляя клеточный контекст, в котором наблюдаются эти белки. Различные стратегии сбора данных могут использоваться в зависимости от имеющихся пакетов программного обеспечения и, самое главное, в зависимости от требований к образцу. Молекулярные или неадгезивные образцы на медной сетке ТЕА очищенного белка обычно требуют меньшего обращения и, таким образом, остаются плоскими и неповрежденными в идеальных случаях. Электронные томограммы могут быть легко установлены последовательно через дыряво-углеродную сетку, чтобы быстро получить от десятков до сотен томограмм систематическим образом. Самым простым способом для пользователей настроить образцы молекулярной томографии, где белки в изобилии присутствуют в сетке, было бы использование Tomo5 (программное обеспечение для 3D-электронной томографии, используемое в настоящем исследовании, см. Таблицу материалов). Другие томографические программы, такие как Leginon⁹ и serialEM⁶, также доступны; они предлагают больше вариантов настройки для более персонализированных подходов к сбору данных, но являются более сложными и, следовательно, могут быть более трудными для навигации, особенно для пользователей, не знакомых с томографией, и пользователей, получающих удаленный доступ к своему сеансу. Для объекта с большой и разнообразной базой пользователей Tomo5 прост в эксплуатации в удаленной среде и в обучении пользователей. Для адгезивных ячеек сетки обычно требуют больше шагов обработки, а необходимость использования хрупких золотых сеток увеличивает потребность в улучшенной осторожности в стратегиях обработки и сбора данных. Чтобы облегчить поиск интересующей клеточной области и избежать окклюзии от самой сетки при высоких углах наклона, также полезно использовать большие размеры ячеек, но за счет того, что они по своей сути более хрупкие. Для образцов ламелей хрупкость образца определяется качеством ламели, которое может быть переменным. Эти факторы увеличивают время настройки и соображения, но повышенная адаптивность и надежность снова делают Tomo5 подходящим для этого типа сбора данных. Однако для каждого рабочего процесса существуют специализированные сценарии сбора данных. BISECT и PACE-tomo (оба работают в SerialEM) вводят возможность смещения лучевого изображения во время получения томографии для увеличения скорости сбора томограмм²⁸, особенно в молекулярной томографии. Монтажи среднего увеличения (MMM) в SerialEM ^6,7,33 могут лучше идентифицировать и точно нацеливаться на молекулярные особенности во всех рабочих процессах, хотя на момент написания статьи эти функции начинают реализовываться в Tomo5.

Как и SPA, крио-ET и STA становятся все более доступными благодаря улучшениям, внесенным в программное обеспечение для приобретения, и множеству доступных пакетов для субтомограммы в среднем ^{16,17,32,34,35,36,37,38}. Кроме того, во время пандемии обеспечение удаленного доступа к крио-ЭМ-приборам стало необходимым для продолжения работы национальных объектов, таких как Центр электронной биовизуализации (eBIC) в Diamond Light Source (DLS), Великобритания. Эти разработки сделали крио-ET более доступным и надежным для исследователей, желающих использовать эту технику. После получения данных STA является важным инструментом для анализа повторяющихся объектов для получения реконструкции с максимальным разрешением и классификации макромолекулярной гетерогенности. Текущий протокол направлен на обеспечение подробного пошагового руководства по подготовке крио-ТЕА-микроскопа для сбора крио-ET данных и как выполнить усреднение субтомограммы с использованием emClarity на молекулярном томографическом наборе данных апоферритина в качестве примера. Использование emClarity (программное обеспечение для криоэлектронной томографии высокого разрешения и усреднения субтомограмм, см. Таблица материалов) требует запуска скриптов из командной строки, поэтому предполагается уровень знакомства с системами Linux/UNIX.

Удаленное подключение зависит от сетевой среды в каждом институте/учреждении. В eBIC удаленная система использует программы, которые позволяют удаленно собирать данные о конкретной конфигурации сети, используемой в Diamond. Удаленное подключение к микроскопу облегчается двумя платформами: NoMachine и TeamViewer (см. Таблицу материалов). Используя программу NoMachine, пользователь может авторизоваться на удаленном рабочем столе Windows. Удаленный рабочий стол Windows, предоставляемый NoMachine, находится в той же сети, что и микроскоп, и, таким образом, действует как виртуальный поддерживающий ПК для микроскопа. С виртуального ПК поддержки пользователь подключается к микроскопу через TeamViewer, обеспечивая прямой доступ и управление микроскопом ПОД УПРАВЛЕНИЕМ TUI и Tomo.

Настоящий протокол состоит из двух частей (этап 1 и этап 2). Шаг 1 фокусируется на удаленном сборе крио-ET данных с помощью Tomo5 (программное обеспечение для 3D-электронной томографии). Пошаговое руководство для (удаленного) сеанса захватывает изображения со все более высоким увеличением, чтобы в конечном итоге позволить пользователю направить программное обеспечение томографии на целевые области образцов для сбора томографических данных. На рисунке 1 показан этот процесс. Шаг 2 детализирует крио-ET STA обработку данных с использованием emClarity (программное обеспечение для криоэлектронной томографии высокого разрешения и усреднения субтомограмм). На рисунке 9 показан этот процесс.

Протокол предназначен для удаленной аудитории. Он предполагает, что человек физически за микроскопом и загрузкой образцов сделал прямые выравнивания и позаботился о настройке камеры и получении эталона. Для этого протокола предполагается трехконденсаторная линзовая система с автозагрузчиком. Для получения дополнительных подробных рекомендаций по программному обеспечению томографии подробное руководство от производителя доступно в кнопке Пуск Windows, откуда было загружено программное обеспечение.

протокол

Программные пакеты, используемые в данном исследовании, частично находятся в свободном доступе (см. Таблицу материалов).

1. Удаленный сбор крио-ET данных с помощью Tomo5

1. Если программное обеспечение не загружено, начните с запуска этого программного обеспечения с серверного ПК ТЕА (см. Таблицу материалов).
2. Выполните первоначальные проверки и настройте условие создания образа, выбрав «Стили».
   1. Начните настройку сеанса, настроив параметры получения изображения на вкладке "Подготовка" в разделе Пресеты (рисунок 2A,B).
      1. Отрегулируйте «Обзорное увеличение» в соответствии с размером квадрата сетки и дозой, чтобы получить адекватные подсчеты.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если подходящее увеличение неизвестно для типа сетки, вернитесь к этому шагу после загрузки сетки.
      2. «Эвцентрическая высота» и «поисковое увеличение» могут быть одинаковыми. Нажмите « Поиск » на вкладке «Томография», чтобы настроить позиции и убедиться, что увеличение достаточно, чтобы показать интересующий признак и уместить область «Экспозиция» и «Отслеживание / Фокус» в поле зрения (рисунок 2C).
      3. Установите для параметра "Увеличение экспозиции" желаемый размер целевого пикселя. Если это неизвестно, установите его, отрегулировав увеличение в соответствии с желаемым полем зрения в соответствии с интересующей областью.
   2. Скопируйте параметры получения изображения (Exposure) во все остальные пресеты с высоким увеличением (Tracking, Drift, Focus, Thon Ring, Zero Loss,). Для этого нажмите Set (Установить ), чтобы установить «Экспозицию» для микроскопа, и Get , чтобы получить «Настройки экспозиции» для всех других высоких увеличений после их выбора по отдельности.
      1. Отрегулируйте время экспозиции, особенно для «Фокуса» и «Отслеживания», чтобы дать соответствующее количество отсчетов, также учитывая толщину в 60 °, то есть как под 0 °, так и под 60 °, чтобы достаточное количество электронов прошло через образец, чтобы обеспечить сильный сигнал для перекрестной корреляции.
         ПРИМЕЧАНИЕ: По оценкам, время экспозиции для «Отслеживания» и «Фокусировки», равное предустановке «Экспозиция», является хорошей первой мерой. Пример расчета дозы для предустановки "Экспозиция" см. на рисунке 3. Установите расчетное время экспозиции для пресета «Экспозиция» на вкладке «Подготовка».
   3. Отрегулируйте «Zero Loss Preset», чтобы использовать более яркий и больший размер пятна (больший размер пятна соответствует меньшему числу), так как для этого требуется более высокая доза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот пресет лучше всего использовать для выравнивания щели энергетического фильтра, если он присутствует на микроскопе.
3. Выполните сбор атласа, выполнив следующие действия.
   1. Чтобы собрать атлас, нажмите « Новый сеанс » на вкладке «Атлас», задайте настройки сеанса, введите путь хранения и формат вывода и нажмите «Применить». Выберите Скрининг (рисунок 4) и отметьте галочкой все атласы, которые необходимо получить. Выберите Закрыть клапаны Col , чтобы оставить микроскоп без присмотра; это закроет клапаны колонн после того, как все выбранные атласы будут собраны. Чтобы начать показ, нажмите кнопку Пуск .
   2. Проверьте один или несколько атласов на предмет целей, щелкнув по сетке в левой панели в разделе «Экранирование» (рисунок 4), затем щелкните левой кнопкой мыши и перетащите мышь, чтобы перемещаться, и среднюю прокрутку, чтобы увеличить и уменьшить масштаб. Выберите сетку для целевой установки, выберите ее и нажмите Загрузить образец изнутри программного обеспечения.
   3. Для калибровки сдвига изображения продолжайте использовать вкладку экранирования атласа для навигации по загруженной сетке. Найдите идентифицируемый объект, который будет узнаваем при всех предустановках увеличения, то есть кристалл льда, перекрывающийся краем отверстия или другой узнаваемой особенностью (рисунок 5). Перейдите к этому квадрату щелчком правой кнопкой мыши, затем «Переместить этап в квадрат сетки».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ступень должна быть на эйцентрической высоте, чтобы правильно реализовать калибровку сдвига изображения.
4. Выполните калибровку сдвига изображения.
   1. На вкладке "Auto Functions" (рисунок 6) установите для шаблона настроек "Eucentric Height", перейдите к "Auto-Eucentric by Stage Tilt" и нажмите Start. Следите за окном состояния, чтобы убедиться, что поиск эйцентрической высоты является успешным, и следите за положительными и отрицательными изображениями наклона; они должны коррелировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с версии 5.8 программного обеспечения Tomo критерий принятия эйцентрической высоты может быть изменен; значение по умолчанию равно 0,25 мкм, и установка его на 0,5-0,8 мкм дает больше свободы действий. Значения зависят от производительности микроскопа, но рекомендуется, чтобы они были как можно меньше.
      1. Находясь на эйцентрической высоте и в фокусе, центрируйте сцену на объекте. Соберите предварительный просмотр с помощью пресета "Atlas". Установите все "Пресеты" на вкладке "Подготовка". Впоследствии увеличьте увеличение до обзора > центральную функцию > предварительного просмотра, затем повторите «Увеличение поиска» и, наконец, «Увеличение экспозиции».
   2. Если объект оставался центрированным во время таргетинга, пропустите калибровку сдвига изображения. В противном случае, чтобы откалибровать сдвиг изображения, перейдите на вкладку «Подготовка», выберите «Откалибровать сдвиг изображения» и нажмите «Пуск » (рисунок 5). Это будет итеративно выравнивать более низкие увеличения к объекту, центрированному на увеличении экспозиции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если начальная предустановленная «Экспозиция» не центрирована на этом этапе, для переориентации программное обеспечение будет использовать сдвиг стадии только для этого шага.
      1. Нажмите Продолжить для предустановки "Экспозиция". Следующим показанным изображением будет "Стиль поиска". Чтобы откалибровать сдвиг изображения между пресетами, дважды щелкните левой кнопкой мыши в предварительном просмотре «Поиск» там, где находится центр предварительного просмотра «Экспозиция», затем нажмите Re-acquire (рисунок 5). Нажмите « Продолжить», чтобы перейти к следующей паре пресетов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время этой калибровки был применен сдвиг изображения при увеличении атласа, убедитесь, что атлас повторно получен после завершения калибровки сдвига изображения. Выберите нужный атлас и нажмите Reset Selected на верхней панели во вкладке "Atlas". Подтвердите и начните приобретать этот атлас снова.
5. Выполните настройку томографии.
   1. Создайте настройку сбора данных томографии во вкладке "Томография".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если специально не указано, настройка выполняется полностью во вкладке «Томография».
   2. Запустите новый сеанс. В разделе "Настройка сеанса" для биологических образцов выберите Slab-like в качестве типа образца и выберите Пакетная и низкая доза, выберите выходной формат и папку хранения, при необходимости добавьте получателя электронной почты, а затем нажмите применить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь становится доступен пункт меню "Пакетные позиции" (рисунок 7A). Загруженный в данный момент атлас автоматически импортируется. «Обзорные» и «Поисковые изображения» могут быть получены и повторно получены до тех пор, пока не будет получено новое изображение. Кроме того, начиная с версии 5.8, поисковые карты из плиток 3 x 3, 4 x 4 и 5 x 5 можно получить с помощью «Получить карту поиска», чтобы упростить поиск и настройку цели. Они соответствуют варианту монтажей среднего увеличения.
   3. Чтобы настроить цели, перейдите к «Стрелке Атласа», найдите интересующую область и переместитесь туда, выбрав опции, которые всплывают щелчком правой кнопки мыши. Сделайте обзорное изображение, чтобы подтвердить хорошее положение для регулировки высоты эйцентрика, затем нажмите на Auto Eucentric; это будет запускать эйцентрическую процедуру наклона по ступеням. Затем повторно приобретите новое обзорное изображение, чтобы обновить высоту эйцентрика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кнопка "Автофокус" не должна быть необходимой, если позиция находится на эйцентрической высоте. Если изображение эйцентрической высоты кажется далеко не в фокусе, высота эйцентрика, вероятно, неверна и должна быть переделана (для устранения неполадок с высотой эйцентрика см. раздел обсуждения).
   4. Проверьте цель с помощью пресета «Обзор» перед настройкой первой позиции; выберите предустановленную настройку "Обзор" и наклоните сцену на ±60°, чтобы проверить, на каком расстоянии от полос сетки можно установить позиции (рисунок 8). Выполните это, введя нужное значение угла наклона в окно "Set Tilt" (рисунок 8A).
   5. Осмотрите квадрат «Обзор» или полученную «Карту поиска», перейдите в интересующую область и нажмите «Получить поиск». Проверьте изображение "Поиск". Если интересующая область не центрирована, щелкните правой кнопкой мыши в нужном положении и повторите команду Переместить этап сюда и Получить изображение. Установите для параметра Наклон (°) значение 0,00 (или любой другой начальный угол, который может обрабатывать рабочая область), чтобы определить начальный угол томограммы.
      1. Для первой томограммы введите Имя для требуемого соглашения об именовании томограммы и Дефокус , чтобы установить желаемое значение расфокусировки для каждой томограммы.
      2. Опционально, начиная с версии Tomo 5.8, значения расфокусировки можно систематически изменять за один раз; для этого нажмите «Выбрать позиции», выберите позиции, которые необходимо изменить, или поставьте галочку, чтобы выбрать все позиции, а затем нажмите «Обновить расфокусировку » и отрегулируйте параметры (рисунок 7A).
   6. Отрегулируйте области «Фокус» и «Отслеживание» (рисунок 2C). Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы перетащить области отслеживания и фокусировки (желтые и синие круги). Убедитесь, что область отслеживания/фокусировки (в основном) сосредоточена на углероде или другой подходящей функции отслеживания, т.е. аналогичной функции интересующей области; избегайте трещин, загрязнения льдом, чрезмерно толстых областей и пустых отверстий.
      1. При выборе пустого углерода без многих функций отслеживания убедитесь, что область начинает гореть на полпути через томограмму, выбрав достаточно высокую дозу для фокусировки и отслеживание, чтобы медленно сжигать образец при более высоких наклонах. Это может быть полезно для поддержания точности отслеживания. Убедитесь, что область отслеживания/фокусировки не раскрывает более позднюю область приобретения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с тем, что близко и что войдет в луч. Избегайте областей с функциями, которые будут вмешиваться в отслеживание и / или экспозицию, включая полосы сетки.
   7. Нажмите Добавить позицию после того, как все параметры будут установлены и желаемая область интереса, а также «Фокус» и «Отслеживание» будут определены. Повторите для новых целей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить, правильно ли откалибрована высота эйцентрика для позиций партии, которые были настроены, существует несколько доступных стратегий. Рекомендуется выбирать один из них в зависимости от типа выполняемой томографии (молекулярная, клеточная, ламельная).
   8. Для молекулярной томографии, предполагая, что сетки довольно плоские, а эйцентрическая высота была выполнена в центре каждого квадрата, содержащего целевые позиции, пропустите процедуру «Уточнить все» (или Уточнить выбранные, если позиции были выбраны, рисунок 7A). Если Томо борется с автоматическим эйцентризмом по сценическому наклону, возможно, нажмите на Skip Eucentric.
      1. Для образцов ячеек или ламелей каждое положение партии может иметь различную z-высоту. Либо используйте «Уточнить все», чтобы быть осторожным, либо не отмечайте опцию «Пропустить Eucentric».
         ПРИМЕЧАНИЕ: "Уточнить все" будет перебирать все томограммы, которые были настроены или выбраны с помощью "Выбрать позиции"; уточните высоту эйцентрика и выполните отслеживание и фокусировку перед сбором данных. Эта процедура может выявить любое перекрывающееся воздействие из следующей области фокусировки / отслеживания томограммы (рисунок 7B), что следует рассмотреть, прежде чем продолжить.
      2. Проверьте и повторно вернитесь к квадратам, которые не удалось уточнить. Правой кнопкой мыши нажмите на неудачную позицию , чтобы увидеть параметры. Если высота эйцентрика не удалась, найдите «Авто-эйцентрический по наклону ступени» (шаг 1.4.1.), получите новое изображение «Поиск», чтобы обновить высоту z, и «Добавить позицию». Удалите неудавшуюся/ранее инициализированную позицию. Нажмите на опцию Пропустить Eucentric , которая была сделана с помощью «Уточнить все».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если "Уточнить все" не выполняется, то "Пропустить Eucentric" не должен быть отмечен. Tomo5 будет выполнять эвцентрическое уточнение перед получением каждой томограммы; таким образом, позиции, которые не соответствуют эйцентрическому уточнению, будут пропущены.
6. Выполняйте автоматические функции, выполнив следующие действия.
   1. Проверьте настройки для выполнения выравнивания через вкладку «Автоматические функции», перейдя в атласе к области углерода. Доведите эту область до эвцентрической высоты и следуйте порядку выравниваний, как указано ниже.
      1. Запускайте авто-эйцентрический наклон по ступенькам с предустановленной настройкой «Высота Эйцентрика».
      2. Запустите процедуру автофокусировки с предустановленной настройкой «Фокус».
      3. Запустите процедуру Autostigmate с предустановленным "Thon Ring".
      4. Запустите процедуру автокомы с предустановленным "Thon Ring".
      5. Вставьте желаемую диафрагму объектива (рисунок 6B), вероятно, диафрагму 100 мкм, в качестве хорошего компромисса для повышения контрастности образца и только небольшой отсечки в сигнале при очень высоком разрешении.
      6. Повторите процедуру Autostigmate после вставки диафрагмы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При увеличении размеров пикселей около 3 Å и более низких разрешениях процедура Autocoma может завершиться сбоем; в этом случае проверьте и выровняйте центр поворота Томо под прямым выравниванием в пользовательском интерфейсе TEM.
   2. Убедитесь, что процедура центрирования Auto Zero-Loss работает на вашем образце. С предустановленной «Нулевой потерей» в достаточно высокой дозе (шаг 1.2.3) рутина в Auto Functions, скорее всего, будет успешной.
7. Выполните сбор данных.
   1. Чтобы начать автоматическое получение во вкладке «Томография», выберите слэб-аут Сбора данных и задайте нужные параметры (рисунок 7C). Настройка параметров сбора данных: шаг наклона (°), макс. положительный угол (°), макс. отрицательный угол (°), схема отслеживания (рекомендуется: выберите трек/фокус перед захватом). Выберите Закрыть клапаны колонны для схемы высоты эйцентрика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Редко используемыми параметрами являются "Adjust Exposure Time", "Adjust ZLP", "Use Phase Plate" и "Pause After Tilt".
      1. Используйте параметр Adjust Exposure Time (Время коррекции экспозиции ) для томограмм, которые не предназначены для STA, чтобы увеличить время экспозиции в заданном соотношении при более высоких наклонах.
      2. Параметр Adjust ZLP будет выполнять уточнение ZLP после каждой томограммы, независимо от набора периодичности. Он медленный, иногда терпит неудачу без очевидных причин и пропустит это приобретение позиции. Однако он может быть полезен для очень узкой ширины щели, т.е. 3-5 эВ на фильтре Selectris(X).
      3. Использование фазовой пластины используется редко с момента введения DED с энергетическими фильтрами.
      4. Pause After Tilt приостанавливает приобретение, но не допускает каких-либо изменений в программном обеспечении.
   2. Дважды проверьте параметры сбора данных (во вкладке «Подготовка»), согласуйте расчет дозы и желаемую схему наклона, укажите количество фракций (Nr.) в предустановке «Экспозиция», а затем приступайте к сбору.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фракций зависит от образца, параметров сбора и запланированных этапов постобработки, т.е. STA против морфологического анализа, и должно поддерживаться в значениях, где коррекция движения и оценка CTF получают достаточный сигнал. Диапазон в 4-10 фракций является хорошей оценкой, где 4 больше подходит для более толстых образцов и 10 для более тонких молекулярных образцов.
      1. Затем нажмите « Пуск», чтобы начать сбор данных и контролировать первое получение томограммы, чтобы убедиться, что томограммы получены по назначению.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Последние версии программного обеспечения для томографии имеют дополнительную плиту Movie Player во вкладке «Томография», где можно посмотреть полученные томограммы. Будьте терпеливы во время процесса загрузки.

2. Крио-ET STA апоферритина с использованием emClarity

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь программное обеспечение^{emClarity 17} используется для иллюстрации определения крио-ET структуры STA. На рисунке 9 обобщен этот процесс. В качестве примера были взяты шесть наклонных серий апоферритина (EMPIAR-10787). Была применена октаэдрическая симметрия, и окончательная карта имела разрешение 2,86 Å, полученное всего из 4 800 частиц и близкое к частоте Найквиста (2,68 Å).

1. Убедитесь, что пакет программного обеспечения emClarity³⁹ загружен и установлен (см. Таблицу материалов). Установите IMOD для программной обработки⁴⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется базовое знание команд Linux. Более подробное руководство можно найти в ссылке⁴¹, в которой в качестве примера используется набор данных рибосом (EMPIAR-10304) и описываются пошаговые процедуры. Для различных типов образцов белка также доступен ранее опубликованный отчет⁴².
2. Подготовьте входные файлы и каталоги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные кадры были скорректированы MotionCor2 (патч 5 x 5)⁴³ (см. Таблицу материалов). Изображения с коррекцией движения были сложены для создания серии наклона с использованием newstack (IMOD) и вручную выровнены с отслеживанием патчей с помощью Etomo (см. Таблица материалов), с последующей emClarity. Для получения лучших выравниваний рекомендуется проводить смещения и компенсацию наклона в Etomo. Шесть серий наклона переименованы в TS1 в TS6. Ниже приведены инструкции и команды для первой серии наклона (TS1) в качестве примера.
   1. Установите папку проекта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последняя версия программного обеспечения - 1.5.3.11. Все журналы соответствующего программного обеспечения можно найти в локальной папке проекта (.../logFile/emClarity.logfile).
   2. В папке проекта создайте еще одну новую папку, "fixedStacks", и подготовьте входные файлы: TS1.fixed, TS1.xf и TS1.tlt.
      ПРИМЕЧАНИЕ: TS1.fixed: оригинальная наклонная серия, также известная как TS1.st в Etomo. TS1.xf: этот файл содержит координаты преобразования после Etomo tiltalign. TS1.tlt: этот файл содержит углы наклона.
3. Оцените расфокусировку, выполнив следующие действия.
   1. Рассчитайте расфокусировку. Обновите файл параметров с помощью микроскопа и параметров визуализации в соответствии с дополнительной таблицей 1. Скопируйте файл параметров в папку проекта, измените его имя на param_ctf.m и выполните: emClarity ctf estimate param_ctf.m TS1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон файла параметров можно найти в дополнительном файле 1 или в локальном каталоге установки программного обеспечения (.../emClarity_1.5.3.11/docs/exampleParametersAndRunScript/).
4. Проверьте результаты оценки CTF для каждого стека.
   1. Проверьте выровненные стеки (например, aliStacks/TS1_ali1.fixed) с помощью 3dmod и убедитесь, что фидуциальные бусины стерты правильно.
   2. Убедитесь, что файл журнала сообщает о правильности передачи, что можно найти в logfile/emClarity.logfile (рисунок 9).
   3. Проверьте значение расфокусировки (например, fixedStacks/ctf/TS_ali1_psRadial_1.pdf) и убедитесь, что оно соответствует теоретической оценке CTF.
5. Определите субрегионы.
   1. Создайте биннированную томограмму. В папке проекта выполните: sh recScript2.sh -1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшая (по размеру) томограмма для каждого стека будет храниться в новой папке "bin10". Для ускорения процесса координаты одной или нескольких подрегионов могут быть определены в томограмме bin10. Файл скрипта будет находиться в локальном каталоге установки программного обеспечения (.../emClarity_1.5.3.11/docs/).
   2. Определите границы, выбрав шесть точек: x_min, x_max, y_min, y_max, z_min и z_max, чтобы создать одну субрегион. В папке "bin10" выполните: 3dmod TS1_bin10.rec.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если необходимо создать четыре субрегиона в одном наклонном ряду, выберите 6 × 4 = 24 точки. Каждый стек должен иметь один файл модели (*.mod) в папке "bin10".
   3. Конвертируйте файлы модели в формат emClarity. Это создаст новую папку recon. Сохраните все координаты каждого субрегиона в этой папке. В папке проекта выполните: sh recScript2.sh TS1.
6. Собирайте частицы.
   1. Найдите шаблон апоферритина для сбора частиц. Загрузите шаблон из банка данных электронной микроскопии (EMD-10101)⁴⁴. Убедитесь, что размер шаблона в пикселях совпадает с размером необработанных данных. В папке проекта выполните: emClarity rescale ApoF.mrc ApoF_Template_rescale.mrc 3.60 1.34 cpu.
   2. Генерация ТОМОГРАММ с коррекцией CTF для отбора частиц. В папке проекта выполните: emClarity ctf 3d param_ts.m templateSearch.
   3. Выполните отбор частиц для каждого субрегиона. Для набора данных апоферритина выполните поиск шаблона по адресу bin6. Измените параметры Tmp_angleSearch (θ_out, Δ_out, θ_in, Δ_in), чтобы определить диапазон углов и интервалы для поиска в плоскости или вне плоскости в градусах. В папке проекта выполните: шаблон emClarityПоиск param_ts.m TS1 1 ApoF_Template_rescale.mrc O 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге будет сгенерирована папка "convmap_wedge_Type2_bin6". CSV-файл в этой папке (например, TS1_1_bin6.csv) содержит всю информацию о выбранных частицах.
   4. Удалите неправильные частицы с помощью 3dmod. В папке "convmap_wedge_Type2_bin6" запустите: 3dmod .. /cache/TS1_1_bin6.rec TS1_1_bin6.mod.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих районах часто находят неправильные частицы рядом с углеродными краями или ледяными загрязнениями. Выполните щелчок правой кнопкой мыши по неправильным точкам и нажмите backspace на клавиатуре, чтобы удалить их. На этом шаге убедитесь, что большинство ложноположительных точек удалены (рисунок 10).
   5. Измените имя папки "convmap_wedge_Type2_bin6" на "convmap", так как emClarity будет идти и находить информацию о субрегионе в convmap в следующих шагах.
7. Инициализируйте проект. В папке проекта выполните команду emClarity init param0.m, чтобы создать базу данных для emClarity, ApoF.mat.
8. Выполняют реконструкцию томограмм перед STA и выравниванием. Для генерации CTF-скорректированных подрегиональных томограмм в bin4 выполните: emClarity ctf 3d param0.m.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CTF-скорректированные томограммы (например, cache/TS1_1_bin4.rec)  будут сгенерированы в новой папке "cache".
9. Выполните STA и выравнивание.
   1. Проводят усреднение с помощью СУБТОМОГРАММ с коррекцией CTF, начиная с bin4. В папке проекта выполните: emClarity avg param0.m 0 RawAlignment.
   2. Продолжайте выполнять выравнивания и выполняйте: emClarity alignRaw param0.m 0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап усреднения генерирует ссылку, которая будет использоваться emClarity на этом этапе для выравнивания частиц. Параметры Raw_angleSearch (θ_out, Δ_out, θ_in, Δ_in) могут быть изменены для установки диапазона углов и размеров шага для каждого цикла. Поскольку большинство неправильных частиц удаляются из базы данных (шаг 2.6.4), эти угловые настройки для выравнивания могут начинаться с относительно небольшой степени.
   3. Обновите параметры Raw_angleSearch и выполните еще несколько циклов (шаги 2.9.1 и 2.9.2). Чтобы ускорить процесс, выполняйте выравнивание в плоскости и вне плоскости отдельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого биннинга рекомендуется запускать несколько циклов и постепенно уменьшать угловые настройки. Для набора данных ApoF было выполнено еще пять циклов в бункере 4, и более подробная информация приведена в дополнительной таблице 2. Для cycle001 в папке проекта выполните: emClarity avg param1.m 1 RawAlignment, а затем emClarity alignRaw param1.m 1.
   4. Очистите перекрывающиеся частицы. В папке проекта выполните: emClarity removeDuplicates param5.m 5.
10. Выполняйте уточнения серии Tilt с помощью tomoCPR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным.
    1. Запустите tomoCPR для уточнения геометрии стека. В папке проекта выполните: emClarity tomoCPR param5.m 5.
    2. Создайте новые выровненные стеки и обновите файлы геометрии. В папке проекта выполните: emClarity ctf update param6.m.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что новые файлы геометрии (например, fixedStacks/ctf/TS1_ali2_ctf.tlt) и вновь выровненные стеки (например, aliStacks/TS1_ali2.fixed) созданы правильно.
    3. Создавайте новые субтомограммы в bin2. В папке проекта выполните: emClarity ctf 3d param6.m.
       ПРИМЕЧАНИЕ: За этим последуют несколько циклов для усреднения и выравнивания в bin2 (этапы 2.9.1, 2.9.2 и 2.9.3), очистка дубликатов (этап 2.9.4) и дополнительная tomoCPR (этап 2.10). Из-за высокой симметрии для апоферритина было проведено еще пять циклов при bin2. Обновите параметры Raw_angleSearch для каждого цикла.
11. Выполните окончательную реконструкцию.
    1. Продолжайте выполнять несколько циклов в bin1 и tomoCPR (шаг 2.9 и шаг 2.10). Еще 10 циклов в bin1 были выполнены для набора данных апоферритина. Более подробную информацию о командах и параметрах можно найти в таблице 2.
    2. Выполните окончательную реконструкцию, объединив два половинных набора данных. В папке проекта выполните: emClarity avg param21.m 21 RawAlignment, затем emClarity avg param21.m 21 FinalAlignment.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Будет сгенерирована окончательная карта (например, с B-коэффициентом 10, cycle021_ApoF_class0_final_bFact-10.mrc), рисунок 11.

Результаты

Для образцов клеток и ламелей стратегия сбора данных во многом зависит от образца и цели исследования изображений (рисунок 1). Подход к таргетированию зависит от того, является ли молекулярная мишень in situ или получена из очищенного макромолекулярного комплекса для образцов реконструкции с высоким разрешением, содержащих молекулярные мишени. Для очищенных комплексов, остекленных на дырявых (углеродных) сетках, нацеливание может быть просто основано на визуализации в отверстиях (углеродной) опорной пленки. Для работы in situ подход таргетирования требует знания местоположения молекулярного объекта на основе коррелятивных данных или известных клеточных ориентиров с низким увеличением. Сотовые ориентиры в идеале должны быть идентифицированы при съемке обзорных изображений и, если этого достаточно для грубой локализации интересующих областей, могут обеспечить быстрый способ подтверждения целевой идентичности с помощью поискового изображения. Однако, если наблюдаемые события редки, то могут потребоваться изображения поиска со средним увеличением, чтобы квалифицировать цель правильно. Поисковые карты представляют собой монтажи поисковых изображений со средним увеличением и могут, таким образом, значительно облегчить поиск цели, где они могут быть получены при увеличении, при котором видна интересующая особенность. Затем можно просматривать карты поиска, чтобы найти и настроить целевые позиции пакета. Для образцов, содержащих клеточные особенности для ультраструктурной реконструкции, подход таргетирования аналогичен, хотя и в равной степени зависит от видимости клеточного события при различных увеличениях и его распространенности в образце.

Необходимо также рассмотреть стратегию сбора данных; во всех случаях цель исследования во многом определяет способ сбора данных. Для реконструкции клеточной ультраструктуры может быть уместно низкое увеличение (20-5 Å/px) и большое поле зрения, но для реконструкции молекулярных деталей или деталей с высоким разрешением (5-1 Å/px) требуются большие увеличения. Набор данных, собранный при 1,5 Å/px в идеальных условиях, только физически сможет произвести реконструкцию на частоте Найквиста 3,0 Å/px; однако в действительности многие факторы, включая, но не ограничиваясь, толщиной, размером и неоднородностью образца, влияют на качество полученной реконструкции. Точные параметры изображения также уравновешивают увеличение, основанное на цели исследования, с полем зрения, чтобы содержать достаточно информации. В данной статье представлена субтомограмма усредненного случая, достигающая 2,86 Å, но дополнительные исследования 17,42,43,44,45 представлены в Таблице 1, чтобы проиллюстрировать параметры коллекции, связанные с исследованиями, нацеленными на различные исходы 17,42,45,46.

Как только рабочий процесс таргетинга и режим сбора данных для крио-ET установлен, возможен сбор данных из множества различных типов образцов. Здесь представлены репрезентативные томограммы различных образцов: молекулярные образцы, такие как апоферритин (фильм 1), тонкие клеточные процессы (фильм 2) и фрезерованная FIB пластинка толстого клеточного образца (фильм 3).

Рисунок 1: Обзор настройки рабочего процесса томографии. Рабочий процесс крио-ET визуализации, описанный в протоколе, отображается в виде блок-схемы. Изображения, которые, как ожидается, будут получены, показаны для клеточного и молекулярного рабочего процесса. Представленное название следует соглашению Tomo5, хотя большинство программного обеспечения для сбора томографий разделяют общие принципы сбора этих изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Вкладка подготовки и предустановленные условия поиска. (A) Обзорное изображение всей вкладки. На этой вкладке задаются стили условий обработки изображений, а в раскрывающемся списке «Задачи» можно найти «Калибровка сдвига изображения» и «Настройки фильтра изображений». (B) Увеличение раскрывающегося списка "Пресеты", где каждый пресет может быть выбран для настройки отдельных условий изображения. (C) Изображение, изображающее адекватное увеличение, чтобы поместить как экспозицию, так и область «Фокус и отслеживание» в поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Расчет дозы. Пример расчета дозы для возможных схем получения томограмм, где мощность дозы была измерена в вакууме. Два расчета определяют время (ы) экспозиции для каждого наклона, будь то оптимальная доза на наклон или оптимальная общая доза для серии полного наклона. При усреднении субтомограмм принято нацеливать оптимальную дозу на наклоненное изображение в диапазоне 3,0-3,5 e^-/Ų. В обоих случаях «Дроби (Nr.)» устанавливаются равными 6 для достижения ~0,5 e^-/Ų дозы на кадр наклона фильма для достаточного сигнала для выполнения коррекции движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Вкладка Atlas. Обзорное изображение вкладки "Атлас". Изображение было обрезано, чтобы избежать пустых пробелов в позициях сетки. Меню «Задачи» содержит настройки сеанса и пространства выбора сетки для индивидуального выбора всех инвентаризованных сеток, а также возможность получения одного атласа после удаления кассеты из автозагрузчика. Выбранную сетку можно сбросить, а затем повторно получить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Калиброванные сдвиги изображения. Изображение изображает изображение экспозиции и поиска. Красный крестик на поисковом изображении — это смещенный маркер для исправления смещения между экспозицией и поиском. Следует повторить калибровку сдвига изображения в начале сеанса или после изменения предустановок состояния изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Автоматические функции и диафрагмы. (A) На вкладке «Автофункции» отображаются раскрывающиеся списки «Пресеты» и выбор «Задача». Синим цветом подчеркивается предустановка «Thon Ring», необходимая для «Autostigmate» (также подчеркнута синим цветом) и «Autocoma». Необходимо выбрать соответствующие пресеты для каждой задачи, а затем нажать кнопку Пуск . (B) Диафрагмы находятся в пользовательском интерфейсе ТЕА. Выберите желаемую «Объективная диафрагма» после выполнения автоматических функций и запустите «Автостигмат» с диафрагмой в. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Обзор вкладки томографии. Изображения показывают пользовательский интерфейс Tomo 5.8. (A) Позиции партии. Последние функции, изображенные на изображении: опция «Получить поисковую карту»; позиции томограмм отображаются в виде атласа с опцией увеличения; в правом верхнем углу выделено "Выбрать позиции"; ниже все четыре позиции были выбраны для параметров "Обновить расфокусировку". (B) На поисковой карте выбираются три позиции, обозначенные как 1, 2 и 3. Позиция 1 не будет представлять проблемы при выполнении "Уточнить все". Однако, если в условиях высокой плотности цели, например, при выборе позиций ламелей, как показано для позиции 2 и позиции 3, то «Уточнить все» запустит процедуру «Отслеживание» и «Фокус» в области «Экспозиция» позиции 2, обнажая цель до того, как томограмма будет получена. Тип сетки R1.2/1.3. Шкала = 1,2 мкм. (C) Сбор данных. Выбранные позиции в разделе "Пакетные позиции" теперь можно приобретать индивидуально. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Определение максимального угла наклона. На рисунке показан пошаговый подход к определению максимального диапазона наклона для получения томограмм. (A) обзор на 0° и поисковая карта в центре квадрата сетки. Чтобы проверить диапазон наклона, угол можно установить в программном обеспечении томографии с помощью «Установить наклон (°)», набрав нужное значение и нажав Set. (B) Ступень была наклонена до -60°, что показывает, что угол поисковой карты не будет полностью получен при -60°. (C) Ступень наклонена до 60°. Подсчитав отверстия, которые исчезли при ±60°, можно получить представление о диапазоне наклона квадрата сетки. Шкала = 2,5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Блок-схема emClarity. Блок-схема описывала различные этапы усреднения криомтомограммы. Шкала стержней = 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Сопоставление шаблонов с использованием emClarity. (A) Типичная микрофотография апоферритина на сетке с графеновым покрытием. Расфокусировка: −3,430 мкм. (B) Срез томограммы, наложенный на точки модели после поиска шаблона. (C) Вид верхней и (D) боковой проекции модельных точек, указывающий на один плоский слой монодисперсных частиц апоферритина. Шкала стержней = 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Крио-ET STA апоферритина. (A) Окончательная карта после 21 цикла выравнивания субтомограмм. (B) График корреляции оболочек Фурье (FSC) окончательной карты с заявленным разрешением 2,86 Å, содержащий 38 конусных FSC. (C) Репрезентативные карты плотности (снабжены моделью PDB 6s61⁴⁷). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Образец	Крио-ET тип	Å/px	Диапазон наклона (+/-)	Шаг наклона (°)	Диапазон расфокусировки (мкм)	Общая доза (e-/Å2)	Резолюция	Необработанные данные	Ссылка
Апоферритин	Очищенный/молекулярный (STA)	1.34	60	3	1.5 – 3.5	102	2.86	ЭМИАР-10787	17 и этот документ
Затыкание рта на ВИЧ-1	Очищенный/молекулярный (STA)	1.35	60	3	1.5 – 3.96	120	3.1	ЭМИАР-10164	17
Рибосома	Очищенный/молекулярный (STA)	2.1	60	3	2.2 – 4.3	120	7	ЭМИАР-10304	42
Всплеск SARS-CoV-2	Ламели/молекулярные (STA)	2.13	54	3	2 – 7	120	16	ЭМИАР-10753	45
Структура аксона нейрона	Сотовый (ультраструктурный)	5.46	60	2	3.5 – 5	90	Н.Д.	ЭМИАР-10922	47

Таблица 1: Параметры сбора для нескольких криоэт-исследований. Исследования, направленные на реконструкцию молекулярных деталей из очищенных белков или белков in situ , по сравнению с исследованием, направленным на разрешение и сегментацию ультраструктурных клеточных особенностей.

Фильм 1: Томограмма образцов апоферритина на обычной эм-сетке, а затем изображение с помощью крио-ТЭМ, оснащенного камерой сверхвысокого разрешения с совместимым фильтром. Клоновые ряды были получены с дозосимметричной схемой, с диапазоном наклона 54° и общей дозой 134 e^-/A² в программном обеспечении электронной томографии. Шкала = 50 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 2: Томограмма первичного нейрона, выращенного на эм-сетке, а затем непосредственно изображенного с помощью крио-ТЭМ, оснащенного камерой сверхвысокого разрешения с совместимым фильтром. Серия наклона была получена с дозосимметричной схемой, с диапазоном наклона 60° и общей дозой 120 e^-/A² в программном обеспечении электронной томографии. Шкала = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Фильм 3: Томограмма цианобактерии на эм-сетке, подвергнутая фрезерованию FIB, а затем сфотографированная с помощью крио-ТЭМ, оснащенного высокоскоростной камерой и совместимым фильтром. Клонные ряды были получены с дозосимметричной схемой, с диапазоном наклона 50° и общей дозой 120 e^-/A² в программном обеспечении электронной томографии. Шкала = 87,2 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Дополнительный файл 1: Шаблон файла параметров для оценки расфокусировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Сбор данных и сведения о настройке микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Список команд в порядке выполнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Томо5
Описание рабочего процесса программного обеспечения томографии выделяет один потенциальный и наиболее оптимизированный способ настройки (удаленного) сеанса периодической томографии. Хотя программное обеспечение легко для начинающих, некоторый первоначальный опыт крио-ЭМ и базовое понимание томографии могут помочь с настройкой. Критические шаги выделены в протоколе и должны помочь в устранении неполадок, даже если был использован другой подход к установке. Развитие программного обеспечения облегчит (удаленный) сбор данных и сделает крио-ET более доступным для широкой пользовательской базы. Ниже описано несколько советов и рекомендаций, которые могут помочь в устранении часто встречающихся проблем.

Одним из важных моментов для обсуждения является выбор сеток, потому что при наклоне образца на ±60° полосы сетки при высоких наклонах могут скрывать вид (рисунок 8). В сетке ТЕА размер сетки относится к количеству квадратов сетки на единицу длины сетки. Большие числа сетки имеют больше квадратов сетки на единицу длины, более высокую плотность квадратов сетки и меньшие квадраты сетки, то есть сетка из 400 ячеек имеет меньшие квадраты, чем сетка из 200 ячеек. Хорошим выбором сеток для томографии являются 200-сетчатые или 300-сетчатые сетки. Как показано на рисунке 8, доступная площадь для сбора уменьшается по мере наклона сетки. При наклоне ±60° 300-сетчатая сетка будет иметь небольшое поле зрения, на котором можно получить полную томограмму. Преимущества 200-сетчатых сеток заключаются в том, что большие квадраты сетки ускоряют установку молекулярной томографии, а с увеличением площади квадрата сетки одного квадрата, вероятно, будет достаточно для ночного сбора. Недостатком является то, что 200-сетчатые сетки более хрупкие, поэтому обработка и обрезка требуют большей тонкости.

Кроме того, при использовании дырявой опорной пленки (см. Таблицу материалов) на эм-сетках необходимо учитывать расстояние между отверстиями для настройки фокусировки и области отслеживания по отношению к области экспозиции. В идеале диаметр луча при желаемом увеличении должен быть достаточно мал, чтобы покрыть область углерода, прилегающую к зоне воздействия вдоль оси наклона, для оптимальной и быстрой настройки. Таким образом, могут быть приобретены потенциальные области интереса в каждом отверстии.

Поскольку процедура эвцентрической высоты программного обеспечения в настоящее время не так надежна, как процедура serialEM, следующие советы могут обойти эту проблему. Если определение высоты эйцентрика не удается с помощью предустановки высоты эйцентрика, можно вместо этого использовать предустановку обзора и повторно запустить «Автоматический эйцентрический наклон по наклону ступени»; это может решить проблемы, если высота эвцентрика находится далеко от 0. Если это удастся, можно повторно запустить «Auto-eucentric by stage tilt» с предустановками «Eucentric Height» для повышения точности. Если это не удается, можно запустить «Auto-Eucentric by beam tilt» с предустановленной высотой эйцентрика, а затем повторно запустить «Auto-Eucentric by stage tilt» или вручную установить z-высоту, консолидированную «Auto-Eucentric by beam tilt» в пользовательском интерфейсе TEM в настройках «Stage». В случае использования сеток с повторяющимся рисунком отверстий они могут препятствовать выявлению одного пика перекрестной корреляции. Можно попробовать изменить предустановленную высоту эйцентрика на более низкое смещение расфокусировки, такое как -25 мкм и / или более короткое время экспозиции, чтобы уменьшить перекрестную корреляцию от паттернов отверстий. С другой стороны, использование кружевных сеток/ламелей может не обеспечить достаточный сигнал для сильного пика перекрестной корреляции. Можно попробовать изменить предустановленную эйцентрическую высоту на большее смещение расфокусировки, такое как −75 мкм и/или увеличенное время экспозиции, чтобы усилить пик перекрестной корреляции. Другим вариантом является настройка параметров фильтра изображений; их можно найти во вкладке «Подготовка». Параметры настройки фильтра можно задать для низкого (Обзор/Квадрат сетки), среднего (Эйцентровая высота) и высокого увеличения (Отслеживание/Фокус), чтобы найти оптимальный пик перекрестной корреляции для каждого пресета. Требуемым входом является одно изображение, т.е. под углом 0° и одно при 5°, за которым следует нажатие кнопки Сравнить, чтобы сравнить оба изображения. Рекомендуемое начальное значение для самой длинной длины волны составляет одну четверть шкалы на изображении, а для самой короткой длины волны — одну сороковую часть шкалы. Если пик не идентифицирован надежно, можно оптимизировать настройки до тех пор, пока не будет найден убедительный пик. Нет необходимости каждый раз повторно получать изображения; достаточно просто нажать «Сравнить». Если TOMO по-прежнему не удается автоматически найти высоту эйцентрика, можно использовать ручную калибровку высоты эйцентрика. Следует сосредоточиться на достаточно большом кристалле льда в обзорном увеличении на вкладке «Подготовка», затем перейти к «Управлению сценой» пользовательского интерфейса TEM, установить альфа-канал на −30° и настроить z-значение ступени, чтобы перецентрировать кристалл с помощью флуоресцентного изображения экрана. Выбор настроек «Высокое разрешение» и «Высокая контрастность» в пользовательском интерфейсе TEM сделает это простым (кнопки в нижней части окна флуоресцентного экрана). Опционально, если есть доступ к камере с режимом live, то это можно использовать для определения эйцентрической высоты; это будет проще, чем на флуоресцентном экране.

Самыми большими ограничениями в версиях Tomo5 до 5.8 являются отсутствующие монтажи среднего увеличения, отсутствующая симметричная схема дозы и проблемы, связанные с поиском эвцентрической высоты. Они существуют в serialEM, бесплатном программном обеспечении с быстрой разработкой и поддержкой сообщества, надежной эйцентрической рутиной высоты и возможностью написания сценариев, то есть пользовательской симметричной схемой дозы. Начиная с версии 5.8 в Tomo5, наиболее часто встречающаяся проблема нахождения эйцентрической высоты, т.е. неудачная зацикливание вокруг целевого z-значения, была решена путем реализации опции установки критерия принятия эйцентрической высоты. Тем не менее, при различных типах сетки и образцов настоятельно рекомендуется настроить параметры фильтра изображения, чтобы отразить уникальные условия визуализации отдельных сеансов и дать наилучший возможный пик перекрестной корреляции, чтобы найти высоту эйцентрика и чтобы область фокусировки и отслеживания надежно работали во время получения томограммы.

В целом, многие объекты быстро адаптировались к дистанционной работе во время пандемии. Программное обеспечение Tomo5 обеспечивает легкий доступ и удобный маршрут к томографии, который хорошо подходит для удаленной работы. Достижения, достигнутые в области программного обеспечения, несомненно, будут и впредь делать дистанционный сбор данных и сбор томографий в целом более распространенными в сообществе.

EmClarity
Поскольку emClarity использует метод выбора частиц на основе шаблона, ему необходим шаблон для интересующего объекта. Отбор частиц (шаг 2.6) очень чувствителен и является ключом к конечной структуре. Перед усреднением и выравниванием (шаг 2.9) необходимо тщательно проверить и вручную удалить ложные срабатывания. Когда шаблон недоступен, emClarity может быть непрост в использовании, но для создания исходной модели можно использовать другое программное обеспечение, например Dynamo³⁷ и PEET⁴⁸.

Для гетерогенных образцов emClarity оснащен методом классификации, который позволяет пользователям сосредоточиться на конкретных характеристиках с различными масштабами. Полезно запустить несколько циклов выравниваний перед классификацией и запустить его при более высоком биннинге (например, bin 4 или bin 3).

Актуальная версия программного обеспечения (V1.5.3.11) имеет значительные обновления по сравнению с первым выпуском (V1.0)¹⁷. К ним относятся, но не ограничиваются ими, проверка ручной работы в ходе оценки CTF (этап 2.3); симметрия для выравниваний (CX, I, I2, O); расчет функций выборки 3D на частицу (3DSF); переход на MATLAB 2019a для совместимости и стабильности; и реконструкция с использованием необработанных проекционных изображений (cisTEM). Программное обеспечение будет продолжать совершенствоваться для различных образцов, а последние объявления можно найти в Интернете (см. Таблицу материалов).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Tomography	Thermo Fisher Scientific	5.9.0	Internal terminology: Tomo5 in document
TEM server	Thermo Fisher Scientific	7.10.1
TIA	Thermo Fisher Scientific	5.10.1
DigitalMicrograph	Gatan	3.44
emClarity	Open-Source software	1.5.3.11	Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging
IMOD	Open-Source software	4.11	Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data
MotionCor2	Free for academic use	1.1.0	A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded on dose fractionated movie stacks
ETomo	Open-Source software	4.11	ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands.
NoMachine	NoMachine, freeware	7.9.2	Remote desktop software
TeamViewer	TeamViewer AG	-	Remote access and remote control computer software
Materials
Quantifoil (holey support film) EM grids	Quantifoil	-	A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement
Instrumentation
Titan Krios microscope	Thermo Fisher Scientific	Titan Krios G2
K3 camera and GIB energy filter	Gatan	-
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter	Thermo Fisher Scientific	-
Website
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/	-	-	Link to download the emClarity software package
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/	-	-	Link to download IMOD
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial	-	-	Link to the emClarity online tutorial
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software	-	-	Link to download MotionCor2
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki	-	-	Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity