JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Посттранскрипционные модификации РНК представляют собой недостаточно изученный слой регуляции трансляции, который недавно был связан с пластичностью центральной нервной системы. Здесь описан подход пробоподготовки и жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии для одновременной характеристики многочисленных модификаций РНК в отдельных нейронах.

Аннотация

Посттранскрипционные модификации (ПТМ) РНК представляют собой недостаточно изученный механизм, участвующий в регуляции трансляции в центральной нервной системе (ЦНС). Недавние данные связывают специфические модификации нейронной РНК с парадигмами обучения и памяти. К сожалению, традиционные методы обнаружения этих эпитранскриптомных особенностей способны характеризовать только высокообильные модификации РНК в объемных тканях, исключая оценку уникальных профилей PTM, которые могут существовать для отдельных нейронов в активированных поведенческих цепях. В этом протоколе описан подход — анализ модификации РНК с одним нейроном методом масс-спектрометрии (SNRMA-MS) — для одновременного обнаружения и количественной оценки многочисленных модифицированных рибонуклеозидов в отдельных нейронах. Подход подтвержден с использованием отдельных нейронов морского моллюска, Aplysia californica, начиная с хирургической изоляции и ферментативного лечения основных ганглиев ЦНС для выявления тел нейронных клеток, с последующей ручной изоляцией одного нейрона с использованием острых игл и микропипетки. Далее проводится механическая и термическая обработка образца в небольшом объеме буфера для высвобождения РНК из отдельной клетки для последующего переваривания РНК. Модифицированные нуклеозиды затем идентифицируются и количественно оцениваются с использованием оптимизированного метода жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. SNRMA-MS используется для установления паттернов модификации РНК для одиночных, идентифицированных нейронов из A. californica , которые имеют известные морфологии и функции. Приведены примеры качественной и количественной SNRMA-MS, которые подчеркивают гетерогенное распределение модификаций РНК по отдельным нейронам в нейронных сетях.

Введение

Модификации канонических нуклеозидов РНК все чаще признаются за их мириады ролей в регуляции трансляции белка. На сегодняшний день зарегистрировано более 150 уникальных модификаций РНК, которые варьируются по сложности от метилирования, добавления гетероатома, до конъюгации с клеточными метаболитами 1,2. Этот расширенный алфавит РНК, также известный как эпитранскриптом, генерируется ферментативными писателями и отвечает за изменение стабильности3, сворачивания4 и эффективности трансляции 5,6 клеточных РНК. Некоторые модификации РНК также могут быть обращены вспять с помощью ферментативных ластиков 7,8, тогда как другие добавляются к РНК субстехиометрически 9,10, что создает сложный ландшафт модифицированных и немодифицированных последовательностей РНК в биологических системах.

О важности модификаций РНК в биологической функции свидетельствует неравномерное распределение модификаций по различным органам и тканям, включая субрегионы центральной нервной системы (ЦНС)11. Эта химическая гетерогенность была связана с развитием ЦНС12, реакцией на стресс13 и пластичностью, зависящей от активности14. Субрегионы ЦНС также включают гетерогенные популяции клеток, в которых отдельные клетки демонстрируют различные химические профили 15,16,17,18. Даже отдельные клетки одного типа могут демонстрировать уникальные транскриптомы, отчасти из-за микроокружениятканей 19 и стохастической экспрессии генов20. Однако, хотя характеристика одноклеточного транскриптома является несколько рутинной, не существует аналогичных методов установления одноклеточных эпитранскриптомов для множественных модификаций РНК. Новые подходы, способные профилировать распределение модификаций РНК в отдельных клетках, необходимы для комплексного анализа клеточной гетерогенности и регуляторного влияния посттранскрипционных модификаций (ПТМ) в ЦНС и других биологических системах.

Одновременное измерение многочисленных модификаций РНК в объемных клетках / тканях легко осуществляется с использованием методов жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS). Для анализа LC-MS/MS модифицированных рибонуклеозидов РНК извлекают из клеток (обычно 10 3-10 6 клеток), очищают осаждением и реуспензией, а затем переваривают в нуклеозиды. Затем образец смеси, состоящей из канонических и модифицированных нуклеозидов, вводят в систему LC-MS для разделения и обнаружения аналитов, что приводит к определению полного комплемента модификаций РНК в организме 21,22,23. LC-MS/MS недавно использовался для определения 26 модификаций РНК в ЦНС нейробиологической модели Aplysia californica (A. californica). Обилие некоторых из этих эпитранскриптомных меток продемонстрировало зависящую от времени и региона динамику, которая коррелировала с поведенческими изменениями у животного24. Однако было возможно обнаружить модификации РНК только в объемных образцах, содержащих >103 клеток из-за ограниченной чувствительности метода. Эти более крупные образцы, вероятно, скрывали уникальные и функционально важные профили модификации РНК отдельных клеток со средними популяционными показателями. Хотя тщательный контроль условий подготовки образцов улучшил пределы обнаружения модификаций РНК в малообъемных образцах 25,26,27,28, по-прежнему существует потребность в аналитических методах, которые могут обнаруживать и количественно оценивать множественные модифицированные рибонуклеозиды в отдельных клетках.

Этот протокол вводит анализ модификации РНК с одним нейроном с помощью масс-спектрометрии (SNRMA-MS), который позволяет обнаружить более десятка модификаций РНК в отдельных нейронах из ЦНС A. californica29. Подход состоит из хирургической изоляции одиночных идентифицированных клеток из основных ганглиев ЦНС с последующим оптимизированным рабочим процессом подготовки образцов, включающим механический лизис клеток, денатурацию РНК и ферментативный гидролиз в MS-совместимом буфере. Идентификация и количественная оценка посттранскрипционно модифицированных нуклеозидов затем осуществляется с использованием LC-MS / MS. SNRMA-MS удовлетворяет неудовлетворенную потребность в области анализа модификации РНК, облегчая получение профилей модификации посттранскрипционной РНК для отдельных нейронов и имеет потенциал для будущего применения к другим типам клеток.

протокол

1. Подготовка материалов и растворов

  1. Подготовьте искусственную морскую воду (ASW) с 460 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 10 мМ CaCl2, 22 мМ MgCl2, 26 мМ MgSO4 и 10 мМ HEPES в воде, полученной из системы строгой очистки. Отрегулируйте pH до 7,8, используя 1 M NaOH или HCl. Обычно готовят 1 л ASW и хранят при 14 °C до использования.
  2. Готовят раствор ASW-антибиотиков с 10 000 Ед/мл пенициллина G, 10 мкг/мкл стрептомицина и 10 мкг/мкл гентамицина и хранят при -20 °C. Непосредственно перед экспериментом разморозьте и разбавьте замороженный раствор антибиотиков 1:100 в 20-40 мл ПРОТИВОЛОД. Конечная концентрация антибиотиков в рабочем растворе ASW составляет 100 Ед/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл гентамицина.
  3. Получают буфер переваривания РНК, комбинируя 1 мкл 10 мкг/мкл бычьего сывороточного альбумина, 0,5 мкл 0,5 мкг/мкл пентостатина, 0,495 мкл 2 Ед/мкл щелочной фосфатазы, 1 мкл 0,1 Ед фосфодиэстеразы I (в 10 мМ MgCl2) и 0,38 мкл эндонуклеазы из Serratia marcescens (25 ЕД) на образец. При анализе нескольких образцов подготовьте мастер-смесь в отдельной пробирке, содержащей объем каждого реагента, умноженный на количество анализируемых образцов, плюс еще один для учета случайных потерь реагента от этапов переноса пипетки.
  4. Подготовьте несколько острых игл (стеклянных или металлических) для ручной изоляции нейронов. Изготовьте металлические иглы в домашних условиях путем электрохимического травления вольфрамовой проволоки как в30 или приобретите их. Подготовьте стеклянные иглы из толстых или стандартных настенных боросиликатных стеклянных капилляров (наружный диаметр 1 мм) с помощью съемника микропипетки. Для настоящего способа держите диаметр наконечника иглы в пределах 1-5 мкм, с длиной горлышка 100-150 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление как металлических, так и стеклянных игл может быть оптимизировано для производства инструментов, которые соответствуют индивидуальным потребностям исследователя и конкретной исследуемой биологической модели.

2. Выделение одного нейрона

  1. Охладить раствор 0,33 MMgCl2 до 14 °C. Используя шприц объемом 50 мл, обезболивают A. californica (150-250 г) путем введения раствора MgCl2 в полость тела животного. Наилучшие результаты получены при соотношении объема раствора (мл) к массе тела животного (г) 1:3. Подождите примерно 3 минуты, пока животное расслабится, гарантируя, что оно не проявляет сокращений тела в ответ на тактильную стимуляцию.
  2. Поместите брюшную сторону животного (со стороны ноги) вверх в рассекающий лоток. Рассекните животное хирургическими ножницами одним тупым кончиком, расположенным в сторону животного, аккуратно сделав продольный разрез через ногу.
  3. Прикрепите ростральную, каудальную и боковую стороны тела животного, чтобы обнажить внутренние органы и ганглии ЦНС, расположенные в полости тела. Изолируйте крупные ганглии ЦНС от животного путем хирургического разрыва нервов и некоторых соединительных соединений, происходящих из ганглиев.
  4. Погрузить ганглии в раствор протеазы XIV типа из Streptomyces griseus (10 мг/мл в растворе ASW-антибиотиков) и инкубировать при 34 °C в течение 30 мин или 1 ч (для церебрального ганглия).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации зависит от сезона, размера и состояния животного, а также целевых нейронов. Выделение одних нейронов требует более длительной инкубации, чем других, и должно определяться экспериментально.
  5. Промыть ганглии 6x раствором ASW-антибиотиков и перенести все ганглии в силиконовую форму с полимерным покрытием, заполненную раствором ASW-антибиотиков, используя полипропиленовую трансферную пипетку, которая была разрезана до отверстия ~ 5 мм. Обработайте пипетку 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в ASW, чтобы свести к минимуму прилипание ганглия к пипетке (необязательно). Держите ганглии погруженными в противолодочную оборону в любое время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное лечение снижает механическую стабильность нейронов и окружающей соединительной ткани и, как следствие, нейронные мембраны могут быть повреждены из-за воздействия воздуха во время переноса ганглиев.
  6. Зажмите ганглии и используйте микроножницы и тонкие щипцы, чтобы удалить ганглиозные оболочки. При достаточно сильной ферментативной обработке для снятия оболочки используют стеклянные или металлические иглы.
  7. Визуально идентифицируют интересующие нейроны A. californica . В этой работе были изучены следующие клетки: R2 в брюшном ганглии, LPl1 в плевральном ганглии, метацеребральные клетки (MCC) в мозговом ганглии и клетки B2 в щечном ганглии. Сделайте оптические изображения всех нейронных и ганглионных препаратов с помощью калиброванного микроскопа с общим увеличением в 20 раз, чтобы определить размеры и объемы каждого типа клеток.
  8. Используя натянутый стеклянный капилляр или острые вольфрамовые иглы, тщательно изолируйте идентифицированную клетку от объемного ганглия.
  9. Вытяните небольшое количество (1 мкл) ПРОТИВОЛО в пластиковую микропипетку, а затем перенесите изолированную клетку в пробирку для ПЦР, содержащую 4 мкл 0,365 М ацетата аммония (рН 9,2). Для пустых измерений собирают 5 мкл аликвот раствора ASW-антибиотиков из чашки, содержащей ганглий, и смешивают с буфером пищеварения (описано ниже).

3. Лизис клеток и сбраживание РНК для SNRMA-MS

  1. Лизируют изолированные нейроны путем повторной аспирации и обхода микропипеткой (~100 мкм внутреннего диаметра) в 0,365 М ацетата аммония. Некоторые более мелкие клетки могут не сразу разорваться; чтобы лизировать их, прикладывайте давление по всему диаметру клетки с помощью натянутого стеклянного капилляра.
  2. Используйте термоциклер для нагрева образцов со следующей температурной программой: 95 °C в течение 3 мин, 10 °C в течение 3 мин, держите при 10 °C. Извлеките пробку из термоциклера.
  3. Добавьте 3,375 мкл буфера для переваривания РНК для каждого образца и перемешайте раствор с помощью микропипетки, выведя и дозируя раствор несколько раз. Используйте миниатюрную настольную центрифугу при 2700 х г в течение 30 с, чтобы раскрутить любые капли жидкости, цепляющиеся за стенки трубки ПЦР.
  4. Инкубируйте образцы в термоциклере при 37 °C в течение 3 ч, а затем держите при 10 °C (нагретая крышка установлена на ON). Сразу после того, как образец остынет до 10 °C, переместите 7 мкл раствора во флакон автосамплера, оснащенный вставкой на 250 мкл, стараясь избежать образования пузырьков в трубке автосамплера.

4. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ однонейронных дайджестов и аутентичных модифицированных нуклеозидных стандартов с использованием системы LC-MS/MS, оснащенной электрораспылительным источником ионизации и шестипортовым отводным клапаном.

  1. Для подготовки системы LC к разделению канонических и модифицированных нуклеозидов уравновешивают колонну C18 (150 мм x 2,1 мм, размер частиц 2,2 мкм, диаметр пор 120 Å) с 99% подвижной фазой A (5 мМ ацетата аммония, рН 5,6) и 1% подвижной фазой B (60/40 подвижной фазы A/ацетонитрила (ACN)) со скоростью потока 0,2 мл/мин в течение 12 мин при 36 °C. Используйте растворители класса LC-MS для приготовления подвижных фаз.
  2. Пока LC уравновешивается, калибруйте масс-спектрометр, вводя 1 мМ раствор ацетата натрия в 50/50 ACN/воду в масс-спектрометр через шприцевой насос со скоростью потока 5 мкл/мин. После калибровки повторно подключите поток LC к масс-спектрометру.
  3. Программируют следующие параметры линейного градиента: 1% B в течение 0-5 мин, 5% B в течение 9 мин, 7% B в 11 мин, 10% B в 13 мин, 15% B в течение 32 мин, 40% B в 38 мин, 50% B в 43 мин, 100% B в 50 мин, 100% B в 60 мин, 1% B в 61 мин, и 12-минутное повторное уравновешивание при 1% В перед следующей инъекцией.
  4. Работа прибора МС в положительном режиме со следующими параметрами: капиллярное напряжение установлено на уровне 4 500 В, температура сушки 275 °C,N2 сушильного газа 5 л/мин и распылительный газ 1 бар. Установите отводной клапан на отходы в течение первых 2 минут анализа и на источник в течение оставшейся части пробега.
  5. Собирайте масс-спектры в диапазоне м /з 110-600. Выбор ионов для диссоциации, вызванной столкновением, при 35-40 эВ в течение цикла 3 с использованием предпочтительного списка масс, построенного с использованием базы данных2 и окна изоляции ± 0,5. Используйте активное исключение, чтобы исключить ионы из фрагментации после трех спектров.
  6. Установите динамическое получение спектров MS/MS для ионов с интенсивностью выше и ниже 50 000 при 4 Гц и 1 Гц соответственно и минимальное пороговое значение для выбора ионов при 1 990 отсчетах.
  7. Для количественных SNRMA-MS построить калибровочные кривые с использованием пиковых областей экстрагированной ионной хроматограммы (EIC), полученных для модифицированных нуклеозидных эталонов при минимум пяти концентрациях, чтобы обеспечить интерполяцию неизвестных эндогенных концентраций анализируемого вещества.
    НЕЙРОНЫ, полученные от животных с массой тела 150-250 г, обычно требуют калибровочных кривых для модифицированных нуклеозидов в диапазоне от 0,02 пмоль до 2 пмоль, но эти значения могут варьироваться в зависимости от чувствительности прибора.

5. Анализ данных

  1. Генерация EIC для модифицированных нуклеозидов (m/z из значений базы данных2). Проверьте идентичность предполагаемых модифицированных нуклеозидов, сравнив их спектры MS2 и характеристики удержания LC со значениями базы данных2. См. Таблицу 1 для списка типичных модификаций РНК, обнаруженных в отдельных нейронах из A. californica.
  2. Вручную интегрируйте пики, соответствующие модифицированным и каноническим нуклеозидам, и записывайте эти значения в электронную таблицу. Нормализуйте пиковую область для каждого модифицированного нуклеозида суммой пиковых областей для канонических цитидина, уридина и гуанозина, обнаруженных в образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аденозин не включен в нормализацию из-за его роли в ЦНС в качестве динамического нейромодулятора31.
  3. Построить матрицу данных, состоящую из каждого образца одного нейрона и соответствующих нормализованных пиковых областей для модифицированных нуклеозидов, которые демонстрировали отношение сигнал/шум >10. Выполните анализ главных компонентов (PCA) и отобразите первые два основных компонента на графике оценки. Построение линейных калибровочных кривых из пиковых областей KIK, полученных из последовательного разбавления нуклеозидных эталонов, и расчет концентраций обнаруженных аналитов.

Результаты

SNRMA-MS включает ручную изоляцию идентифицированных нейронов в небольшие объемы образцов для лизиса, пищеварения и анализа LC-MS / MS (рисунок 1A). Этот рабочий процесс регулярно обнаруживал более десятка модификаций РНК в отдельных нейронах из ЦНС A. californica (рисунок 1B), представляя собой покрытие почти половины известного эпитранскриптома этого животного24 в одной клетке. Например, подвергание нейрона LPl1 (диаметр ~500 мкм) SNRMA-MS привело к обнаружению 15 ± 1 модификации РНК (n = 3). Модифицированные нуклеозиды были положительно идентифицированы на основе трех признаков: свойств удержания LC, точной массы и профилей фрагментации MS2 по сравнению со значениями, представленными в базе данных2. В таблице 1 приведен список всех модификаций РНК, обнаруженных в нейроне LPl1. Использованный для этих экспериментов квадрупольный масс-спектрометр высокого разрешения позволил получить точность массы 4 ppm, а также обнаружить характерный ион фрагмента MS2 при m/z 164 для модифицированного нуклеозида N6,6-диметиладенозина (m66A, рисунок 1B). В сочетании с данными разделения LC, которые согласуются с результатами, депонированными в базе данных (m66A элюируется после N6-метиладенозина (m6A)), подход SNRMA-MS продемонстрировал правильное присвоение модифицированных нуклеозидных идентичностей.

Платформа SNRMA-MS может быть использована для создания профилей модификации РНК отдельных нейронов и исследования их связи с объемными тканями. Нейроны R2 представляют собой большие (~ 500 мкм в диаметре) холинергические клетки, которые находятся в брюшном ганглии. SNRMA-MS использовался для анализа модификаций РНК в нейронах R2, а также в окружающих объемных брюшных ганглиях (рисунок 2A). Нормализованные пиковые области для модификаций РНК в каждом образце нейрона/ганглия (n = 7) использовались в качестве входных данных для PCA, показывая, что нейроны R2 демонстрируют различные профили модификации РНК по сравнению с ганглиями, в которых они находятся (рисунок 2B). Об этом свидетельствуют данные о нейронах R2 и брюшных ганглиях, занимающих различные области графика оценки PCA. Дальнейшая поддержка уникальных модифицированных нуклеозидных паттернов была получена из отдельной когорты животных (n = 7), в которой были выполнены парные сравнения для 13 модификаций РНК, которые обычно обнаруживались как в отдельных нейронах, так и в объемной ткани (рисунок 2C). Два модифицированных нуклеозида, псевдоуридин (Ψ) и 2'-O-метилгуанозин (Gm), были значительно выше в абдоминальных ганглиях по сравнению с нейронами R2. При просмотре подмножества модификаций РНК с указанными парами нейрон-ганглий R2 все брюшные ганглии демонстрировали более высокие уровни Ψ и Gm, и все, кроме одного из нейронов R2, имели более высокое содержание 2'-O-метиладенозина (Am), чем их соответствующий ганглий (рисунок 2D). В целом, результаты SNRMA-MS впервые показывают, что профили модификации РНК отдельных клеток могут отличаться от объемных клеток в одной и той же ткани.

Использование SNRMA-MS для исследования модели животного A. californica дает уникальную возможность охарактеризовать профили модификации РНК в идентифицированных, функционально отличных нейронах. Модификации РНК оценивали с помощью SNRMA-MS в четырех идентифицированных клетках: R2 и LPl1 (гомологичные холинергические клетки, участвующие в защитном высвобождении слизистой)32, MCC (серотонинергические модулирующие нейроны, участвующие в питании)33 и клетки B2 (пептидергические нейроны, участвующие в подвижности кишечника)34. PCA шести модификаций РНК в этих идентифицированных нейронах, либо выделенных сразу после ферментативного лечения, либо культивированных в ганглиозном препарате в течение 48 ч, продемонстрировали стабильность и динамику одноклеточных эпитранскриптомов. Модификации РНК в функционально различных клетках образовывали уникальные кластеры на оценочном графике, в то время как гомологичные нейроны R2/LPl1 совместно группировались (рисунок 3A). График загрузки показывает, что различия были обусловлены главным образом обилием позиционных изомеров метиладенозина, включая 2'-O-метиладенозин (Am) и N1-метиладенозин (m1A) (рисунок 3B). В том же анализе проводилось сравнение свежеизолированных клеток и клеток, культивируемых in situ (т.е. в соответствующих ганглиях) в течение 48 ч. Как показано на графике оценки PCA, функционально разные клетки оставались различимыми по их профилям модификации РНК.

Количественная SNRMA-MS может быть использована для определения абсолютных количеств избранных модификаций РНК, для которых доступны аутентичные стандарты. Внешние калибровочные кривые были сгенерированы для m1A, Ψ, 2'-O-метилцитидина (Cm), Am иm6A, а количество каждого модифицированного нуклеозида в парах клеток MCC и R2/LPl1 определяли путем интерполяции (рисунок 4A-E). Внутриклеточные величины m1A и Ψ в двух парах симметричных MCC оказались похожими, в то время как большие различия в количествах этих модификаций наблюдались в трех парах клеток R2 / LPl1. Чтобы учесть различия из-за физического размера изученных клеток, величины модификации РНК были нормализованы клеточными объемами, рассчитанными из оптического измерения диаметров клеток, чтобы получить внутриклеточные концентрации модифицированных нуклеозидов. Значительные различия во внутриклеточных концентрациях Cm и Am наблюдались между MCC и нейронами R2/LPl1. В целом, SNRMA-MS обеспечивает как качественное, так и количественное профилирование модификаций РНК в отдельных нейронах.

figure-results-6219
Рисунок 1: Рабочий процесс SNRMA-MS и обнаружение множественных модификаций РНК в отдельных нейронах с помощью LC-MS/MS. (A) Фотографии дешифрованного буккального ганглия и выделения одного нейрона в пробку. Шкала = 200 мкм, стрелки указывают на идентифицированную ячейку B1. Также показана схема процедуры пробоподготовки для анализа LC-MS/MS. (B) Наложенные EIC для модификаций РНК в одном нейроне LPl1 со вставкой, показывающей спектры MS1 и MS2 для N6, N6-диметиладенозина (m66A). В таблице 1 приведены значения m/z , используемые для генерации ОИК для модифицированных нуклеозидов. Эта цифра была изменена с29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7306
Рисунок 2: SNRMA-MS различает профили модификации РНК отдельных нейронов и объемной ткани. (A) Схема A. californica CNS и рабочий процесс для анализа нейронов R2 и окружающего брюшного ганглия. На фотографии изображен брюшной ганглий и нейрон R2 (вводится краситель Fast Green для видимости). (B) Относительные пиковые области из 13 модификаций РНК использовались для генерации графиков оценки PCA (вверху) и загрузки (внизу). (C) Попарное сравнение модификаций РНК в брюшном ганглии и нейроне R2. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение ±1 (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10−4, парный t-тест с поправкой Бонферрони−Холма. (D) Сравнение отдельных модификаций РНК из панели C, в которой R2-абдоминальные ганглиозные пары для каждого животного показаны с помощью капельных линий. Эта цифра была изменена с29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8646
Рисунок 3: Профилирование модификаций РНК в идентифицированных, функционально отличающихся нейронах из графика оценки A. californica CNS. (A) PCA для MCC и клеток B2, R2 и LPl1, которые были либо недавно выделены, либо изолированы после культуры in situ в течение 48 ч (обозначенных cMCC, cB2, cR2, cLPl1) и (B) графиков загрузки для шести модификаций РНК, обычно обнаруживаемых в этих клетках. Эта цифра была изменена с29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-9522
Рисунок 4: Количественная SNRMA-MS в нейронах A. californica . Количественный SNRMA-MS обеспечивает абсолютные количества и внутриклеточные концентрации для нескольких модифицированных нуклеозидов в одиночных, идентифицированных нейронах A. californica . Фотографии (A) левого и правого MCC (LMCC и RMCC соответственно) в мозговом ганглии и (B) R2 в брюшном ганглии и LPl1 в плевральном ганглии. Ячейки обведены для улучшения видимости. Линейные калибровочные графики для (C)m 1A и (D) Ψ (треугольники), используемые для интерполяции модифицированных нуклеозидных количеств в отдельных ячейках (цветные точки). Пары клеток от каждого животного маркируются 1-3. (E) Внутриклеточные концентрации пяти модифицированных нуклеозидов в клеточных парах MCC и R2/LPl1. Толстые линии соединяют пары ячеек. *p < 0,05, **p < 0,005, парный t-тест с коррекцией Бонферрони−Холма, n = 2 животных (всего четыре клетки) для MCC и n = 3 животных (всего шесть клеток) для R2/LPl1. Эта цифра была изменена с29. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Модификация РНКСокращениеПорядок элюирования (C18)м/з для KIKм/з для MS2
дигидроуридинD1247.09115
псевдоуридинY2245.08209/179/155
3-метилцитидинм3С3258.11126
N1-метиладенозинм1А4282.12150
5-метилцитидинм5С5258.11126
N7-метилгуанозинм7Г6298.12166
2'-O-метилцитидинСм7258.11112
инозинИ6А8269.09137
2'-O-метилгуанозинГм9298.12152
N2-метилгуанозинм2Г10298.12166
N2,N2,N7-триметилгуанозинм227Г11326.15194
N2,N2,-диметилгуанозинм22Г12312.13180
2'-O-метиладенозинЕсмь13282.12136
N6-метиладенозинм6А14282.12150
N6,N6-диметиладенозинм66А15296.14164
N6-изопентениладенозини6А16336.17204/136/148

Таблица 1: Модификации РНК, обнаруженные в одиночных нейронах из A. californica. Приведены атрибуты для характеристики модифицированных нуклеозидов, включая порядок удержания LC, m/z для генерации EIC и соответствующие фрагменты CID.

Обсуждение

SNRMA-MS использует оптимизированный подход к подготовке образцов, в результате чего получается небольшой, совместимый с MS объем образцов, который может быть доставлен на платформу LC-MS. Первоначальная ферментативная предварительная обработка ганглиев ЦНС диктует как легкость, с которой они могут быть удалены, так и долговечность отдельных нейронов во время изоляции. Церебральный ганглий часто требует длительного ферментативного лечения из-за его относительно толстой оболочки по сравнению с щечными, плевральными и брюшными ганглиями. Отдельные исследователи, выполняющие изоляцию отдельных нейронов, могут иметь разные предпочтения в отношении того, насколько прочной должна быть оболочка при использовании микросублиц и тонких щипцов. Однако важно, чтобы ганглии не переваривались, так как это может привести к потере их структурной целостности, потере позиционной информации, которая имеет решающее значение для идентификации клеток-мишеней, и / или лизису клеток. После выделения из ганглия важно обеспечить аспирацию минимального объема изоляционной среды при переносе нейрона в пробоотборную трубку. Противолодочная среда содержит высокую концентрацию солей, которые могут мешать пищеварительным ферментам во время гидролиза РНК, а также разбавляют образец.

Во время этапа механического лизиса крупные нейроны (диаметром >250 мкм) разрываются при многократном прохождении через микропипетку. Меньшие нейроны могут потребовать дополнительного внимания для обеспечения лизиса клеток, который обычно включает в себя надавливание стеклянного капилляра на клетку. В этом случае возможно, что частичный объем буфера образца будет втянут в капилляр из-за капиллярных сил. Этот объем может быть доставлен обратно в пробирку, применяя давление к концу стеклянного капилляра, чтобы гарантировать, что образец не будет потерян.

Наилучшие результаты получаются при включении стадии нагрева перед добавлением ферментов для переваривания РНК. Вероятно, это связано с тем, что нагревание при 95 °C денатурирует вторичные структуры РНК, которые могут препятствовать активностиRNases 35 и уменьшать количество нуклеозидов, высвобождаемых из биополимеров РНК. Контрольные эксперименты с использованием образцов, наполненных метионином, меченым стабильными изотопами, ранее проводились для изучения того, были ли артефакты модификации РНК, индуцированные теплом, причиной увеличения пиковых областей, наблюдаемых для модификаций РНК по сравнению с безтепловым протоколом SNRMA-MS29. Такой маркировки не наблюдалось, что указывает на то, что улучшенные сигналы для модификаций РНК с использованием оптимизированного метода SNRMA-MS были обусловлены превосходным перевариванием РНК.

Традиционные методы выделения общей РНК из клеток включают жидко-жидкостную экстракцию (LLE) фенол-хлороформом и последующее осаждение РНК, промывку и повторное суспендирование. Эти подходы оказались полезными для экспериментов с полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией, где экспрессия избранных генов может быть легко контролироваться в идентифицированных нейронах A. californica 36,37. Однако методы LLE не могут восстановить достаточное количество РНК для обнаружения модифицированных рибонуклеозидов LC-MS, тогда как метод SNRMA-MS, описанный в настоящем описании, позволяет обнаружить многочисленные модификации РНК29. Для оценки профилей модификации конкретных типов РНК (например, рРНК, тРНК, мРНК) в объемных образцах тканей/клеток были применены подходы анионообменной твердой фазы24, обогащения38 на основе зонда гибридизации и хроматографического фракционирования39, но аналогичные методы еще не доступны для очистки одноклеточной РНК. Разработка подходов к фракционированию РНК, которые способны выделять определенные типы РНК из отдельных клеток, даст дополнительное представление о функции модификаций РНК.

SNRMA-MS выявила ранее неохарактерную гетерогенность в ландшафте модификации РНК отдельных нейронов в A. californica , и вполне возможно, что аналогичные различные профили PTM существуют в клетках млекопитающих. Поскольку клетки млекопитающих относительно малы по сравнению с большими нейронами A. californica , проанализированными в этом протоколе, необходимы улучшения в обработке небольших объемов образцов для облегчения более низких пределов обнаружения. Хотя в настоящее время SNRMA-MS ограничена объемами ~ 5 мкл, ожидается, что существенные улучшения могут быть достигнуты путем включения микрофлюидных устройств обработки жидкостей в рабочий процесс. Кроме того, внедрение автоматизированной или полуавтоматизированной изоляции клеток увеличит пропускную способность образца и позволит проводить анализ модификации одноклеточной РНК более крупных клеточных популяций. При сопряжении с нанопотоковыми LC-разделениями27 характеристика эпитранскриптомных меток в еще меньших клетках будет достижима.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным институтом по борьбе со злоупотреблением наркотиками в рамках премии No. P30DA018310 и Национальный научно-исследовательский институт генома человека под номером РМ1ХГ010023. K.D.C. признает поддержку со стороны постдокторской стипендии Института Бекмана. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения финансирующих учреждений.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Aplysia californicaNational Resource for Aplysia (Miami, FL)150–250 g (adult)
Benchtop equipment
Glass capillary pullerSutterP-97
Milli-Q water purification systemMillipore
Minicentrifuge for PCR tubesLW ScientificZS-1
Optical MicroscopeZeissStemi 2000C
ThermocyclerTechneEW-93945-01
HPLC column and consumables
Acclaim RSLC 120 C18 columnThermo Scientific71399
Autosampler vialsThermo ScientificC4011-13
LC and MS Instrumentation and Software
DataAnalysis 4.4 softwareBruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLCThermo ScientificEquipped with online degasser, autosampler, and thermostatted column compartment
Impact HD UHR QqTOF mass spectrometerBrukerEquipped with ESI source
RStudioRStudio
Microdissection tools
Microscissors extra fine vannas 3.5”RobozRS-5640
Tungsten needlesRobozRS-6065
Reagents/Materials
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane-sulfonic acid (HEPES)Fisher ScientificH3375
Alkaline phosphataseWorthington Biochemical Corp.LS004081
Ammonium acetateHoneywell17836
Benzonase (endonuclease from S. marcescens)EMD Millipore70746-4
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
Calcium chlorideSigma-AldrichC4901
Gentamycin sulfateFisher ScientificG1264
Magnesium chlorideSigma-AldrichM9272
Magnesium sulfateSigma-Aldrich208094
Nucleosides test mixSigma-Aldrich47310-U
Penicillin GSigma-AldrichP7794
PentostatinSigma-AldrichSML0508
Phosphodiesterase IWorthington Biochemical Corp.LS003926
Protease type XIV from Streptomyces griseusSigma-AldrichP5147
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Standard glass capillariesA-M Systems6260001 mm o.d., 0.5 mm i.d., 4 in
Streptomycin sulfateSigma-AldrichS9137

Ссылки

  1. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, 195-201 (2011).
  2. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46, 303-307 (2017).
  3. Kimura, S., Waldor, M. K. The RNA degradosome promotes tRNA quality control through clearance of hypomodified tRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (4), 1394-1403 (2019).
  4. Helm, M. Post-transcriptional nucleotide modification and alternative folding of RNA. Nucleic Acids Research. 34 (2), 721-733 (2006).
  5. Rezgui, V. A. N., et al. tRNA tKUUU, tQUUG, and tEUUC wobble position modifications fine-tune protein translation by promoting ribosome A-site binding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12289-12294 (2013).
  6. Shanmugam, R., et al. Cytosine methylation of tRNA-Asp by DNMT2 has a role in translation of proteins containing poly-Asp sequences. Cell Discovery. 1 (1), 1-10 (2015).
  7. Jia, G., et al. N 6-Methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology. 7 (12), 885-887 (2011).
  8. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N 1 -methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  9. Krogh, N., et al. Profiling of 2′-O-Me in human rRNA reveals a subset of fractionally modified positions and provides evidence for ribosome heterogeneity. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7884-7895 (2016).
  10. Babaian, A., et al. Loss of m1acp3Ψ Ribosomal RNA Modification Is a Major Feature of Cancer. Cell Reports. 31 (5), 107611 (2020).
  11. Chang, M., et al. Region-specific RNA m6A methylation represents a new layer of control in the gene regulatory network in the mouse brain. Open Biology. 7 (9), 170166 (2017).
  12. Wang, C. -. X., et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development. PLOS Biology. 16 (6), 2004880 (2018).
  13. Engel, M., et al. The role of m6A/m-RNA methylation in stress response regulation. Neuron. 99 (2), 389-403 (2018).
  14. Widagdo, J., et al. Experience-dependent accumulation of N6-Methyladenosine in the prefrontal cortex is associated with memory processes in mice. Journal of Neuroscience. 36 (25), 6771-6777 (2016).
  15. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  16. Cong, Y., et al. Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies >1000 protein groups per mammalian cell. Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).
  17. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), 20-29 (2011).
  18. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (17), 6810-6817 (2011).
  19. Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nature Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
  20. Kærn, M., Elston, T. C., Blake, W. J., Collins, J. J. Stochasticity in gene expression: from theories to phenotypes. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 451-464 (2005).
  21. Chan, C. T. Y., et al. A quantitative systems approach reveals dynamic control of tRNA modifications during cellular stress. PLOS Genetics. 6 (12), 1001247 (2010).
  22. Sun, C., Jora, M., Solivio, B., Limbach, P. A., Addepalli, B. The effects of ultraviolet radiation on nucleoside modifications in RNA. ACS Chemical Biology. 13 (3), 567-572 (2018).
  23. Heiss, M., Hagelskamp, F., Marchand, V., Motorin, Y., Kellner, S. Cell culture NAIL-MS allows insight into human tRNA and rRNA modification dynamics in vivo. Nature Communications. 12 (1), 389 (2021).
  24. Clark, K. D., Lee, C., Gillette, R., Sweedler, J. V. Characterization of neuronal RNA modifications during non-associative learning in aplysia reveals key roles for tRNAs in behavioral sensitization. ACS Central Science. 7 (7), 1183-1190 (2021).
  25. Basanta-Sanchez, M., Temple, S., Ansari, S. A., D'Amico, A., Agris, P. F. Attomole quantification and global profile of RNA modifications: Epitranscriptome of human neural stem cells. Nucleic Acids Research. 44 (3), 26 (2016).
  26. Huang, W., et al. Determination of DNA and RNA methylation in circulating tumor cells by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (2), 1378-1384 (2016).
  27. Sarin, L. P., et al. Nano LC-MS using capillary columns enables accurate quantification of modified ribonucleosides at low femtomol levels. RNA. 24 (10), 1403-1417 (2018).
  28. Clark, K. D., Philip, M. C., Tan, Y., Sweedler, J. V. Biphasic liquid microjunction extraction for profiling neuronal RNA modifications by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (18), 12647-12655 (2020).
  29. Clark, K. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry: Characterizing RNA modification patterns and dynamics with single-cell resolution. Analytical Chemistry. 93 (43), 14537-14544 (2021).
  30. Guise, O. L., Ahner, J. W., Jung, M. -. C., Goughnour, P. C., Yates, J. T. Reproducible electrochemical etching of tungsten probe tips. Nano Letters. 2 (3), 191-193 (2002).
  31. Peng, W., Wu, Z., Song, K., Zhang, S., Li, Y., Xu, M. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science. 369 (6508), (2020).
  32. Rayport, S. G., Ambron, R. T., Babiarz, J. Identified cholinergic neurons R2 and LPl1 control mucus release in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 49 (4), 864-876 (1983).
  33. Rosen, S. C., Weiss, K. R., Goldstein, R. S., Kupfermann, I. The role of a modulatory neuron in feeding and satiation in Aplysia: effects of lesioning of the serotonergic metacerebral cells. Journal of Neuroscience. 9 (5), 1562-1578 (1989).
  34. Lloyd, P. E., Kupfermann, I., Weiss, K. R. Central peptidergic neurons regulate gut motility in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 59 (5), 1613-1626 (1988).
  35. Crain, P. F. Preparation and enzymatic hydrolysis of DNA and RNA for mass spectrometry. Methods in Enzymology. 193, 782-790 (1990).
  36. Kadakkuzha, B. M., et al. Age-associated bidirectional modulation of gene expression in single identified R15 neuron of Aplysia. BMC Genomics. 14 (1), 880 (2013).
  37. Akhmedov, K., Kadakkuzha, B. M., Puthanveettil, S. V. Aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51075 (2014).
  38. Tardu, M., Jones, J. D., Kennedy, R. T., Lin, Q., Koutmou, K. S. Identification and quantification of modified nucleosides in saccharomyces cerevisiae mRNAs. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1403-1409 (2019).
  39. Heiss, M., Reichle, V. F., Kellner, S. Observing the fate of tRNA and its modifications by nucleic acid isotope labeling mass spectrometry: NAIL-MS. RNA Biology. 14 (9), 1260-1268 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182Aplysia californica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены