Перекись водорода (H2O2) является одновременно источником окислительного повреждения и сигнальной молекулой. Этот протокол описывает, как измерить митохондриальныйH2O2 с помощью митохондриального HyPer7 (mtHyPer7), генетически кодируемого ратиометрического биосенсора, у живых дрожжей. В нем подробно описывается, как оптимизировать условия визуализации и выполнять количественный клеточный и субклеточный анализ с помощью бесплатного программного обеспечения.
Митохондриальная дисфункция, или функциональные изменения, обнаруживается при многих заболеваниях и состояниях, включая нейродегенеративные и опорно-двигательные расстройства, рак и нормальное старение. В данной работе описан подход к оценке митохондриальной функции в живых клетках дрожжей при клеточном и субклеточном разрешении с использованием генетически кодируемого, минимально инвазивного, ратиометрического биосенсора. Биосенсор, нацеленный на митохондрии HyPer7 (mtHyPer7), обнаруживает перекись водорода (H2O2) в митохондриях. Он состоит из митохондриальной сигнальной последовательности, соединенной с циркулярно перестановленным флуоресцентным белком, и H 2 O2чувствительным доменом бактериального белка OxyR. Биосенсор генерируется и интегрируется в геном дрожжей с помощью системы без маркеров CRISPR-Cas9 для более стабильной экспрессии по сравнению с плазмидными конструкциями.
mtHyPer7 количественно нацелен на митохондрии, не оказывает заметного влияния на скорость роста дрожжей или морфологию митохондрий и обеспечивает количественное измерение митохондриальногоH2O2 в нормальных условиях роста и при воздействии окислительного стресса. В этом протоколе объясняется, как оптимизировать условия визуализации с помощью системы конфокального микроскопа с вращающимся диском и выполнять количественный анализ с помощью свободно доступного программного обеспечения. Эти инструменты позволяют собирать богатую пространственно-временную информацию о митохондриях как внутри клеток, так и между клетками в популяции. Кроме того, описанный здесь рабочий процесс может быть использован для проверки других биосенсоров.
Митохондрии являются важными эукариотическими клеточными органеллами, которые хорошо известны своей функцией в производстве АТФ путем окислительного фосфорилирования и транспорта электронов1. Кроме того, митохондрии являются местами накопления кальция, синтеза липидов, аминокислот, жирнокислотных и железо-серных кластеров, а также передачи сигнала 2,3. Внутри клеток митохондрии образуют динамическую сеть с характерной морфологией и распределением, которая варьируется в зависимости от типа клетки и метаболического состояния. Кроме того, хотя митохондрии могут сливаться и делиться, не все митохондрии в клетке эквивалентны. Многочисленные исследования документально подтвердили функциональную гетерогенность митохондрий в пределах отдельных клеток по таким характеристикам, как мембранный потенциал и окислительное состояние 4,5,6. Эти изменения в митохондриальной функции частично обусловлены повреждением органеллы мутациями мтДНК (которые происходят с большей частотой, чем в ядерной ДНК) и окислительным повреждением активными формами кислорода (АФК), генерируемыми как внутри, так и вне органелл 7,8,9. Повреждение органелл смягчается митохондриальными механизмами контроля качества, которые восстанавливают повреждение или устраняют митохондрии, поврежденные безвозможности восстановления.
Перекись водорода (H2O2) представляет собой активную форму кислорода, которая является источником окислительного повреждения клеточных белков, нуклеиновых кислот и липидов. Однако Н2О2 также служит сигнальной молекулой, регулирующей клеточную активность посредством обратимого окисления тиолов в белках-мишенях11,12. Н2О2 производится из электронов, которые просачиваются из митохондриальной цепи переноса электронов, и специфическими ферментами, такими как НАДФН-оксидаза и моноаминоксидазы 13,14,15,16,17,18,19,20. Он также инактивируется антиоксидантными системами, в том числе на основе тиоредоксина и глутатиона21,22,23. Таким образом, анализ митохондриальных уровнейH2O2имеет решающее значение для понимания роли этого метаболита в нормальном функционировании митохондрий и клеток, а также в условиях окислительного стресса.
Общей целью этого протокола является обнаружение митохондриальногоH2O 2 с помощью генетически кодируемого ратиометрического биосенсора H 2 O 2HyPer7, который нацелен на органеллу (mtHyPer7). mtHyPer7 представляет собой химеру, состоящую из митохондриальной сигнальной последовательности АТФ9 (пресеквенция Su9), циркулярно перестановочной формы зеленого флуоресцентного белка (GFP) и H2O 2-связывающего домена белка OxyR из Neisseria meningitidis24 (рис. 1). В циркулярно перестановленном GFP N- и C-концы нативного GFP сливаются, а вблизи хромофора образуются новые концы, которые придают белку большую подвижность и большую лабильность его спектральных характеристик по сравнению с нативным GFP25. Взаимодействие домена OxyR mtHyPer7 с H 2 O 2 является высокоаффинным, H 2 O2 селективным и приводит к обратимому окислению консервативных остатков цистеина и образованию дисульфидных мостиков. Конформационные изменения, связанные с окислением OxyR, переносятся на циркулярно перестановленный GFP в mtHyPer7, что приводит к спектральному сдвигу максимума возбуждения хромофора mtHyPer7 с 405 нм в восстановленном состоянии до 488 нм в H2O2-окисленном состоянии26. Таким образом, отношение флуоресценции от mtHyPer7 в ответ на возбуждение при 488 нм против 405 нм отражает окисление зондаH2O2.
В идеале биосенсор должен обеспечивать абсолютное количественное считывание целевой молекулы в режиме реального времени. Однако, к сожалению, это не всегда возможно в реальных измерениях. В случае датчиков окисления, таких как mtHyPer7, на показания в режиме реального времени влияет скорость восстановления дисульфидного мостика. Восстановительные системы, используемые биосенсорами АФК, различаются, и они могут существенно изменить динамику ответа зонда, как показано при сравнении HyPer7, восстановленного системой тиоредоксина, и roGFP2-Tsa2ΔCR, восстановленного глутатионом, в дрожжевых цитозоле27. Таким образом, чтобы сделать вывод об относительной концентрацииH2O2по соотношениям mtHyPer7, необходимо предположить, что восстановительная система сохраняет постоянную емкость в течение всего эксперимента. Несмотря на эти соображения, HyPer7 и связанные с ним зонды использовались в различных контекстах для получения информации оH2O2в живых клетках25,28,29.
Рисунок 1: Конструкция, молекулярный механизм и спектры возбуждения/излучения биосенсора H 2 O2 mtHyPer7. (A) Зонд mtHyPer7 получен путем вставки циркулярно перестановленного GFP в домен OxyR-RD из Neisseria meningitidis. Он содержит митохондриальную целевую последовательность субъединицы 9 АТФ-синтазы Neurospora crassa (Su9). (B) Иллюстрация механизма чувствительности H 2 O2mtHyPer7. Окисление цистеинов в домене RD увеличивает флуоресцентное излучение при возбуждении на длине волны 488 нм и уменьшает излучение, производимое возбуждением на длине волны 405 нм. (C) Спектры возбуждения и испускания HyPer7 в окисленной и восстановленной формах. Этот рисунок перепечатан с разрешения Pak et al.24. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; cpGFP = GFP с круговой перестановкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Эта ратиометрическая визуализация mtHyPer7 предлагает важные преимущества для количественного определения митохондриальногоH2O2 24,27; Он обеспечивает внутренний контроль концентрации зонда. Кроме того, сдвиг пика возбуждения, вызванный экспозицией Н2О2, не является полным, даже при насыщающих концентрациях Н2О2. Таким образом, визуализация коэффициентов может повысить чувствительность за счет включения в анализ двух спектральных точек.
Используемый здесь зонд mtHyPer7 имеет очень высокое сродство к H 2 O2 и относительнонизкую чувствительность к pH24 и был успешно нацелен на митохондрии Caenorhabditis elegans 30. Этот белок также используется в дрожжах27,31. Тем не менее, предыдущие исследования основывались на плазмидной экспрессии mtHyPer7, что приводит к межклеточной вариабельности экспрессии зонда27. Кроме того, конструкция, описанная в этом протоколе, была интегрирована в консервативную, свободную от генов область на хромосоме X32 с использованием подхода на основе CRISPR для интеграции без маркеров. Экспрессия интегрированного биосенсорного гена также контролируется сильным конститутивным промотором TEF1 (рис. 2). В результате наблюдается более стабильная, последовательная экспрессия биосенсора в популяциях дрожжевых клеток по сравнению с экспрессией биосенсоров, переносимых плазмидами, и клетки, несущие биосенсор, могут размножаться без необходимости использования селективных сред.
Рисунок 2: Генерация клеток, экспрессирующих mtHyPer7, методом CRISPR. Плазмида (YN2_1_LT58_X2site), содержащая Cas9 и sgRNA, а также ПЦР-амплифицированная мтHyPer7-содержащая биосенсорная конструкция вводятся в почковающиеся дрожжевые клетки путем трансформации ацетата лития. Безгенный сайт вставки на хромосоме X (X2) распознается и разрезается белком Cas9 с sgRNA, а биосенсор интегрируется в геном путем гомологичной рекомбинации. После идентификации успешных трансформантов с помощью микроскопического скрининга, колонной ПЦР и секвенирования плазмида Cas9 удаляется (отверждается) путем выращивания в неселективных средах. Сокращения: sgRNA = однонаправляющая РНК; TEF = фактор усиления транскрипции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, mtHyPer7 имеет преимущества по сравнению с другими биосенсорами АФК. Например, органические красители, используемые для обнаружения АФК (например, дигидроэтидий [DHE]2 и MitoSOX3), могут вызывать неравномерное или неспецифическое окрашивание и часто поставляются в виде растворителей, таких как этанол или диметилсульфоксид, которые требуют дополнительного контроля воздействия растворителей. Другим классом биосенсоров АФК являются биосенсоры на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) (например, редокфтор для окислительно-восстановительного состоянияклеток 4 и перекисные сенсоры HSP-FRET5, OxyFRET 6 и PerFRET6). Эти зонды генетически закодированы и в принципе очень чувствительны и могут быть количественно нацелены на митохондрии с использованием хорошо охарактеризованных митохондриальных сигнальных последовательностей. Тем не менее, существуют проблемы в использовании зондов на основе FRET, в том числе фон из-за перекрестного возбуждения и просвечивания, а также строгие требования к близости и ориентации флуорофоров для возникновения FRET33,34. Кроме того, зонды FRET состоят из двух флуоресцентных белков, которые требуют более крупных конструкций для экспрессии в интересующих клетках по сравнению со зондами, меняющими спектры. Протокол, описанный здесь, был разработан для того, чтобы воспользоваться преимуществами биосенсора на основе HyPer7 и использовать этот компактный, ратиометрический, высокоаффинный, генетически кодируемый зонд для количественной визуализации перекиси в митохондриях у живых дрожжей.
1. Генерация биосенсорной плазмиды, интеграция в геном дрожжей и оценка нацеливания mtHyPer7 на митохондрии и влияния на морфологию митохондрий, скорость клеточного роста или чувствительность к окислительному стрессу
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1, Дополнительную таблицу S1, Дополнительную таблицу S2 и Дополнительную таблицу S3 для конструирования биосенсорных плазмид, штаммов, плазмид и праймеров, соответственно, используемых для конструирования и характеризации биосенсоров. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.
Рисунок 3: mtHyPer7 нацелен на митохондрии и не влияет на морфологию митохондрий, рост клеток или чувствительность к окислительному стрессу. (A) Морфология митохондрий в живых дрожжевых клетках, экспрессирующих mtHyPer7. Левая панель: mtHyPer7, визуализированный с возбуждением 488 нм. Средняя панель: митохондрии, помеченные 250 нМ MitoTracker Red. Правая панель: объединенные изображения. Показаны проекции максимальной интенсивности. Контур ячейки показан белым цветом. Масштабная линейка = 1 мкм. (B,C) Кривые роста и максимальная скорость роста клеток дикого типа и клеток, экспрессирующих mtHyPer7, выращенных в присутствии (+PQ) или отсутствии 2,5 мМ параквата в средах YPD. (Д,Э) Кривые роста и максимальная скорость роста клеток дикого типа и mtHyPer7, экспрессирующих мтHyPer7, выращенных в присутствии (+PQ) или отсутствии 2,5 мМ параквата в средах SC. Все кривые роста являются средними значениями трех независимых репликаций. Максимальные темпы роста представлены в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). Анализ кривой роста проводили путем разбавления ячеек средней логарифмической фазы до наружного диаметра600 0,0035 в 200 мкл соответствующей среды в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Наружный диаметр культуры измеряли каждые 20 мин в течение 72 ч с помощью планшетного ридера. Каждый штамм/состояние был нанесен на три экземпляра и построен график усредненной скорости роста. Максимальная скорость роста (наклон) рассчитывалась с использованием изменения наружного диаметра в течение 240 мин интервала в течение 72 ч. Аббревиатуры: WT = дикий тип; PQ = паракват. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
2. Культивирование клеток и подготовка к визуализации (рис. 4)
Рисунок 4: Рост клеток и визуализация. Почковающиеся дрожжевые клетки, экспрессирующие mtHyPer7, выращивают до середины логарифмической фазы. Изображения серии Z собираются с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском, а затем подвергаются 3D-реконструкции и анализу. Смотрите разделы протокола 2-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
3. Оптимизация условий визуализации и сбора изображений (рис. 5)
Рисунок 5: Оптимизация визуализации . (A) Оценка изображений и гистограмм для правильного диапазона интенсивности. Показаны проекции максимальной интенсивности конфокальных изображений вращающегося диска. Гистограммы показаны как с линейной осью Y (черная), так и с осью Y логарифмической шкалы (серая), чтобы проиллюстрировать динамический диапазон изображения. Левые панели: зашумленное изображение с низкой интенсивностью и динамическим диапазоном. Центральные панели: изображение с приемлемым динамическим диапазоном (~1 000 уровней серого) и интенсивностью. Правые панели: изображение с неправильной контрастностью для получения чрезмерной насыщенности. Масштабная линейка = 1 мкм. (B,C) Анализ фотообесцвечивания mtHyPer7. Последовательные Z-стеки собирались без задержки, Z-стеки суммировались, а средняя интенсивность митохондрий измерялась и нормализовалась до первой временной точки. Показаны результаты из первых трех временных точек (27 экспозиций). (B) Длина волны возбуждения: 405 нм. (C) Длина волны возбуждения: 488 нм. Показанные значения представляют собой средние значения по трем ячейкам из каждого из трех независимых испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
4. Полуавтоматический анализ со скриптами
5. Ручной анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход занимает больше времени, но обеспечивает гибкость в предварительной обработке и установке порогового значения.
Рисунок 6: Схема анализа и представления изображений. Конфокальные изображения вращающегося диска сначала вычитаются из фона. Митохондрии сегментируются по пороговым значениям и преобразуются в маски для каждого среза. Эти маски применяются к обоим каналам, а замаскированные изображения используются для вычисления соотношения. ROI рассчитывается для измерения соотношения mtHyPer7 в клетках или субклеточных областях. Для представления данных также могут быть сгенерированы цветные изображения с пропорциями. Масштабная линейка = 1 мкм. Аббревиатура: ROI = регион интереса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы подтвердить, что mtHyPer7 является подходящим зондом для оценки митохондриальногоH2O2, была оценена локализация mtHyPer7 и его влияние на митохондрии дрожжей и здоровье клеток. Для оценки таргетирования mtHyPer7 митохондрии окрашивали жизненно важным митохондриально-специфическим красителем MitoTracker Red в контрольных дрожжевых клетках и дрожжах, экспрессирующих mtHyPer7. При использовании окрашивания MitoTracker Red митохондрии были решены в виде длинных трубчатых структур, которые выровнялись вдоль оси мать-почка и накапливались на кончике почки и кончике материнской клетки дистальнее зачатка41. Морфология митохондрий была сходной в контрольных клетках и клетках, экспрессирующих mtHyPer7. Кроме того, mtHyPer7 локализовался с митохондриями, окрашенными в красный цвет MitoTracker (рис. 3A). Таким образом, mtHyPer7 был эффективно и количественно нацелен на митохондрии, не влияя на нормальную морфологию или распределение митохондрий.
Затем были проведены дополнительные валидационные эксперименты для оценки влияния mtHyPer7 на клеточную приспособленность и чувствительность к окислительному стрессу в митохондриях. Скорость роста клеток, экспрессирующих mtHyPer7, в богатых или синтетических средах на основе глюкозы (YPD или SC, соответственно) аналогична таковой у нетрансформированных клеток дикого типа (рис. 3B, D). Для оценки возможного влияния на окислительный стресс в митохондриях контрольные и мтHyPer7-экспрессирующие дрожжи обрабатывали низкими уровнями параквата, редокс-активной малой молекулы, которая накапливается в митохондриях и приводит к повышению уровня супероксида в органелле24,27. Если экспрессия mtHyPer7 либо индуцирует окислительный стресс в митохондриях, либо защищает митохондрии от окислительного стресса, то клетки, экспрессирующие mtHyPer7, должны демонстрировать повышенную или пониженную чувствительность к лечению паракватом соответственно. Лечение низкими уровнями параквата приводило к снижению темпов роста дрожжей. Более того, скорость роста клеток дикого типа и клеток, экспрессирующих mtHyPer7, в присутствии параквата была сходной (рис. 3C,E). Таким образом, экспрессия биосенсора не создавала значительных клеточных стрессов в почковавшихся дрожжевых клетках и не изменяла чувствительность дрожжей к митохондриальному окислительному стрессу.
Учитывая доказательства того, что mtHyPer7 подходит для изучения митохондриального H2O2 у почковавшихся дрожжей, было проверено, может ли mtHyPer7 обнаруживать митохондриальный H2O2 у дрожжей дикого типа в середине логарифмической фазы и изменения в митохондриальномH2O2, индуцированные внешним добавлениемH2O2. Был проведен эксперимент по титрованиюH2O2 и измерено среднее отношение окисленный:восстановленный (O/R) mtHyPer7 в митохондриях.
Сценарии автоматизированного анализа выдали несколько выходных файлов.
Изображение соотношения (ratio.tif): Z-стек, состоящий из стеков с коррекцией фона и пороговых значений 488 нм и 405 нм. Этот стек можно посмотреть на Фиджи без дополнительной обработки; Тем не менее, перед просмотром рекомендуется повысить контрастность и/или раскрасить изображение, как описано в шагах протокола 4.3 или 5.6.
Изображение маски (mask.tif): стек Z, состоящий из пороговых митохондриальных областей, используемых для анализа. Это изображение необходимо использовать для оценки точности порогового значения.
Рентабельность инвестиций, используемая для анализа (ROIs.zip): когда этот файл открывается на Фиджи вместе с исходным изображением, ROI накладывается на изображение для перекрестных ссылок на таблицу результатов и исходное изображение. Каждый ROI переименовывается с номером ячейки и номером ROI.
Таблицы измерений (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv), содержащие площадь, среднюю и интегрированную плотность пороговых митохондрий для каждого среза на изображениях числителя, знаменателя и соотношения соответственно. В срезах, где митохондрии отсутствовали или были не в фокусе, регистрируется NaN.
Файл журнала (Log.txt), документирующий параметры, используемые для коррекции фона и шума, порогового значения и вычисления соотношения.
Отношение O/R mtHyPer7 показало дозозависимый ответ на концентрацию H2O2, который достигал плато при 1-2 мМ при внешнем добавленииH2O2(рис. 7). Удивительно, но соотношение HyPer7 было ниже в клетках, подвергшихся воздействию 0,1 мМH2O2, чем в контрольных клетках, хотя эта разница не была статистически значимой. Одним из объяснений этого явления может быть реакция гормезиса, при которой воздействие низкого уровня стрессора может вызывать стрессовые реакции, такие как антиоксидантные механизмы, которые, в свою очередь, снижают количество АФК, обнаруживаемое зондом. Более высокие уровни стрессоров, напротив, могут подавлять внутренние стрессовые реакции и приводить к более высокому считыванию от HyPer7.
Рисунок 7: Реакция mtHyPer7 на добавленный извне H2 O 2. (A) Максимальная проекция возбужденных изображений 405 нм и 488 нм и проекция средней интенсивности ратиометрических изображений mtHyPer7 в клетках средней логарифмической фазы, подвергшихся воздействию различных концентраций H2O2. Псевдоцвет указывает на соотношение окисленный:восстановленный mtHyPer7 (шкала внизу). Масштабная линейка = 1 мкм. Контур ячейки показан белым цветом; n > 100 ячеек на условие. (B) Количественное определение соотношения mtHyPer7 окисленный:восстановленный в почковавшихся дрожжевых клетках, обработанных различными концентрациями H2O2. Показаны средства пяти независимых испытаний с символами различной формы и цвета для каждого испытания. Среднее ± СЭМ соотношения окисленный:восстановленный mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (без обработки), 1,357 ± 0,03295 (0,1 мМ), 2,571 ± 0,3186 (0,5 мМ), 6,693 ± 0,5194 (1 мМ), 7,017 ± 0,1197 (2 мМ). p < 0,0001 (односторонний ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки). Значения p обозначаются как: ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Наконец, предыдущие исследования показали, что более здоровые митохондрии, которые более редуцированы и содержат меньше супероксида, преимущественно наследуются дочерними клетками дрожжей4, и что цитозольные каталазы транспортируются и активируются в дочерних клетках дрожжей42,43,44,45. Эти исследования документируют асимметричное наследование митохондрий во время деления дрожжевых клеток и роль этого процесса в приспособленности и продолжительности жизни дочерних клеток, а также возрастную асимметрию между матерью и дочерью. Чтобы проверить, существуют ли различия вH2O2 между матерями и почками, mtHyPer7 был измерен в почках и материнских клетках. Различия в митохондриях H2O2 наблюдались внутри дрожжевых клеток, а в митохондриях в зародыше было обнаружено незначительное, но статистически значимое снижение показаний биосенсораH2O2по сравнению с таковыми в материнской клетке (рис. 8). Эти результаты согласуются с предыдущими выводами о том, что митохондрии в зародыше лучше защищены от окислительного стресса. Они также предоставляют документацию о том, что mtHyPer7 может обеспечить количественное считывание митохондриальногоH2O2 с клеточным и субклеточным разрешением у почковавшихся дрожжей.
Рисунок 8: Уровень митохондриальныхH2O2ниже в дочерней клетке. (A) Максимальная проекция ратиометрического изображения mtHyPer7 в репрезентативной ячейке. Псевдоцвет указывает на соотношение окисленный:восстановленный mtHyPer7 (шкала внизу). Субклеточные различия в соотношении очевидны (наконечники стрел). Масштабная линейка = 1 мкм. Контур ячейки: белый. (B) Разница между соотношением mtHyPer7 в зародыше и материнской клетке. Для каждой отдельной ячейки значение материнского коэффициента вычиталось из значения соотношения почек и отображалось в виде точки. n = 193 ячейки, объединенные из пяти независимых экспериментов, показанных разными цветными символами для каждого эксперимента. Среднее ± SEM разницы между соотношением mtHyPer7 в зародышевой и материнской клетках: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (парный t-критерий) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица S1: Штаммы, использованные в данном исследовании. Список используемых штаммов дрожжей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S2: Плазмиды, использованные в этом исследовании. Список используемых плазмид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S3: Праймеры, использованные в данном исследовании. Список используемых грунтовок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 1: Протокол построения плазмиды биосенсора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный файл 2: Скрипты для автоматизированного анализа. Для каждого скрипта предоставляются образцы входных и выходных файлов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
В этом протоколе описан метод использования mtHyPer7 в качестве биосенсора для оценки митохондриальногоH2O2в живых почковающихся дрожжевых клетках. Биосенсор конструируется методом на основе CRISPR и вводится в консервативную бесгенную область генома дрожжей без использования селективных маркеров. По сравнению с биосенсорами, содержащимися в плазмиде, интегрированные биосенсоры экспрессируются во всех клетках и на одинаковых уровнях, что обеспечивает более надежные количественные результаты. Для генерации клеток, экспрессирующих mtHyPer7, не используются селективные маркеры, что позволяет использовать более широкий спектр штаммовых фонов и облегчает генетическую модификацию клеток, экспрессирующих биосенсоры. Белок mtHyPer7 правильно нацелен на митохондрии без заметного влияния на морфологию, функцию, распределение или скорость клеточного роста митохондрий. mtHyPer7 демонстрирует дозозависимую реакцию на внешне добавленныйH2O2. Более того, mtHyPer7 способен сообщать о гетерогенности качества митохондрий с субклеточным разрешением. Наконец, использование конфокального микроскопа с вращающимся диском в отличие от широкопольной микроскопии для визуализации митохондриальных биосенсоров приводит к меньшему фотообесцвечиванию флуорофоров и получению изображений с высоким разрешением для анализа субклеточных различий.
Ограничения и альтернативные подходы
Этот метод не подходит для визуализации клеток более 10 минут, так как клетки высохнут под покровным стеклом. Для более длительной визуализации лучше использовать метод агаровой подушечки46 или иммобилизовать клетки в культуральной чашке со стеклянным дном, заполненной средой SC.
При выборе биосенсора следует руководствоваться концентрацией мишени в экспериментальных условиях. Если чувствительность HyPer7 слишком высока, рекомендуется другая версия HyPer, например HyPer3 или HyPerRed47,48. Однако следует отметить, что другие зонды HyPer более чувствительны к pH. Для более высокой чувствительности более подходящим может быть roGFP на основе пероксиредоксина (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Устойчивое состояние окисления датчикаH2O2 связано как со скоростью окисления, так и со скоростью восстановления. Скорость окисления биосенсоров в основном обусловленаH2O2, но скорость восстановления зависит от антиоксидантных восстановительных систем, активных в клетке и органеллах. Показано, что HyPer7 преимущественно восстанавливается системой тиоредоксина в цитозоле дрожжей, и его восстановление происходит быстрее, чем у roGFP2Tsa2ΔCR27. Поэтому при интерпретации измерений биосенсоровH2O2следует учитывать различные механизмы редукции и динамику отклика зонда. В частности, для определения уровняН2О2по показаниям биосенсора необходимо предположить, что система восстановления поддерживает постоянную емкость во время эксперимента. В качестве альтернативы описанным здесь сценариям в свободном доступе имеется множество других программ для анализа окислительно-восстановительных датчиков49.
Критические шаги
В случае с любым биосенсором очень важно продемонстрировать, что сам биосенсор не влияет на измеряемый процесс. Поэтому важно сравнивать рост и митохондриальную морфологию штаммов в каждом экспериментальном состоянии. Здесь морфология митохондрий оценивается с помощью MitoTracker Red, который окрашивает митохондрии в зависимости от мембранного потенциала. Тем не менее, сравнение митохондрий в нетрансформированных и трансформированных биосенсорами клетках может быть выполнено путем окрашивания тетраметилродаминовым метиловым эфиром (TMRM), альтернативным митохондриальным красителем, чувствительным к мембранному потенциалу, или MitoTracker Green, который окрашивает митохондрии независимо от мембранного потенциала. При подозрении на вредные последствия может помочь снижение уровня экспрессии или изменение сайта интеграции.
Валидация характеристик зонда «доза-реакция» и отношения сигнал/шум метода визуализации также важны для получения надежных результатов. Если изменчивость внутри группы превышает изменчивость между группами, различия становится трудно обнаружить. Внутригрупповая изменчивость может быть результатом истинной популяционной изменчивости или шума в процессе обнаружения. Ключевыми шагами для увеличения соотношения сигнал/шум являются получение изображения (диапазон значений пикселей и шум), вычитание фона и пороговое значение.
Шумовые эффекты также могут быть уменьшены на этапах расчета. Самый простой подход заключается в вычислении взвешенной средней интенсивности на основе измерений изображения соотношения (Results.csv), где каждый пиксель представляет локальное соотношение между эффективностью возбуждения. В результате получается «пиксельное» соотношение. Однако, если отношение сигнал/шум изображения низкое, более надежные результаты можно получить, вычислив средневзвешенную интенсивность для ROI как в каналах числителя, так и в канале знаменателя, а затем вычислив отношение между этими двумя средневзвешенными значениями (соотношение «по регионам»).
Чтобы выбрать метод порогового значения, используйте команду Fiji Image | Регулировка | Auto Threshold можно использовать для автоматической опробования всех встроенных методов Fiji. Для оценки сегментации (порогового значения) сохраненная маска преобразуется в выделение нажатием кнопки Редактировать | Выбор | Create Selection, добавляется в ROI Manager (нажатием клавиши T), а затем активируется на файле необработанного изображения. Если митохондрии не обнаруживаются должным образом, следует попробовать другой метод сегментации.
При сравнении изображений важно получить все изображения с одинаковыми условиями изображения, а также отобразить все изображения с одинаковым повышением контрастности.
Движение митохондрий необходимо учитывать при оптимизации условий визуализации. Если митохондрии значительно перемещаются между возбуждением на длине волны 405 и 488 нм, изображение соотношения будет неточным. Рекомендуется поддерживать время экспозиции <500 мс и изменять возбуждение самым быстрым доступным методом (например, триггерным импульсом или акустооптическим перестраиваемым фильтром). При захвате стека Z оба возбуждения должны быть выполнены для каждого шага Z, прежде чем переходить к следующему шагу Z.
Для отображения результатов изменения оттенка (цвета) более очевидны для человеческого глаза, чем изменения интенсивности. Поэтому значение коэффициента преобразуется в цветовую шкалу для облегчения визуальной интерпретации. Цветные изображения могут быть немодулированными, когда все митохондриальные пиксели отображаются с одинаковой яркостью, или с модуляцией интенсивности, когда интенсивность пикселей в исходном изображении используется для установки интенсивности в раскрашенном изображении.
Модификация и устранение неполадок
В качестве альтернативы подтверждению митохондриальной функции с помощью параквата, клетки могут быть реплицированы или инокулированы в ферментируемые и неферментируемые источники углерода.
Для вычитания фона вычитание катящегося шара (перейдя в Process | Вычитание фона...) Также может использоваться для устранения неравномерности освещения. Необходимо убедиться, что наличие ячеек не изменяет вычитаемый фон (установив флажок Создать фон и проверив результат).
Таким образом, зонд mtHyPer7 представляет собой последовательный, минимально инвазивный метод определения морфологического и функционального состояния митохондрий дрожжей в живых клетках и позволяет изучать важный клеточный стрессор и сигнальную молекулу в генетически управляемой, легкодоступной модельной системе.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Авторы благодарят Кэтрин Филпо Лопес (Katherine Filpo Lopez) за экспертную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) (GM122589 и AG051047) LP.
В этих исследованиях использовался общий ресурс по конфокальной и специализированной микроскопии Комплексного онкологического центра Герберта Ирвинга при Колумбийском университете, частично финансируемый за счет гранта NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | #A9126 | |
Bacto Agar | BD Difco | #DF0145170 | |
Bacto Peptone | BD Difco | #DF0118170 | |
Bacto Tryptone | BD Difco | #DF211705 | |
Bacto Yeast Extract | BD Difco | #DF0127179 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #A8094 | |
laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #H5659 | |
L-leucine | Sigma-Aldrich | #L8912 | |
L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #L8662 | |
L-methionine | Sigma-Aldrich | #M9625 | |
L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | #P5482 | |
L-tryptophan | Sigma-Aldrich | #T8941 | |
L-tyrosine | Sigma-Aldrich | #T8566 | |
mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. #856177 | |
RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
Uracil | Sigma-Aldrich | #U1128 | |
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | #DF0919073 | |
YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены