Методика внутрибрюшинной инъекции взрослым рыбкам данио, которая сводит к минимуму повреждение организма и связанную с ним смертность

Резюме

Описан новый метод внутрибрюшинного (IP) введения взрослым рыбкам данио. При работе с токсичными соединениями, такими как доксорубицин, эта процедура более эффективна, чем два ранее описанных метода IP. Этот метод разработан таким образом, чтобы его можно было легко использовать исследователям с ограниченным опытом работы с моделью рыбок данио.

Аннотация

Взрослая рыбка данио рерио (Danio rerio), которая генетически доступна, используется в качестве ценной модели позвоночных для изучения заболеваний человека, таких как кардиомиопатия. Внутрибрюшинная инъекция (ВП) является важным методом, который доставляет соединения в организм либо для тестирования терапевтических эффектов, либо для создания моделей заболеваний, таких как доксорубицин-индуцированная кардиомиопатия (ДВС-синдром). В настоящее время существует два метода внедрения IP. Оба метода имеют ограничения при работе с токсичными соединениями, такими как доксорубицин, что приводит к побочным эффектам, проявляющимся в виде серьезного повреждения формы тела и гибели рыб. Несмотря на то, что эти недостатки могут быть преодолены путем обширной подготовки следователей, желателен новый метод инъекции IP, который имеет минимальные побочные эффекты. В этой статье сообщается об уникальном методе инъекции IP, который способен работать с токсичными соединениями. Постоянное снижение сердечной функции может привести к значительному падежу рыбы. Методику могут легко освоить исследователи, имеющие минимальный опыт работы со взрослыми рыбками данио.

Введение

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) привлекла внимание в качестве экспериментальной модели для изучения болезней человека, потому что это животное включает в себя высокую гомологию генов и органов человека, внешнее оплодотворение, простоту генетических манипуляций и прозрачность тела в раннем возрасте, что облегчает^{множество приложений} визуализации. В отличие от простого процесса доставки лекарств непосредственно в воду для эмбрионов и личинок данио-рерио, введение лекарств взрослым рыбкам данио представляет собой более сложную и трудную задачу^.

У взрослых рыб соединения могут доставляться с помощью пассивных методов доставки лекарств, таких как прямое введение в воду, или с помощью пероральных методов доставки лекарств, таких как гаваган². Другие подходы включают покрытие корма рыб соединениями и последующее кормление рыб³, а также непосредственное введение нерастворимых в воде лекарственных препаратов в заданной концентрации, включая ретроорбитальные или внутрибрюшинные инъекции4,5. Внутрибрюшинное введение предпочтительно для исследований in vivo моделей заболеваний из-за его явных фармакокинетических преимуществ⁶. Этот метод обеспечивает высокую концентрацию препарата и увеличенный период полувыведения в брюшной полости, предлагая эффективный путь доставки препарата ^7,8. Этот подход обычно используется в исследовательских целях для обеспечения оптимального абсорбции и распределения лекарственных средств ⁹. В то время как методы, основанные на инъекциях, оказываются эффективными при однократном родоразрешении, длительные и повторные инъекции часто приводят к повреждению организма и хронической^{инфекции.}

В настоящее время существует два метода инъекции IP у взрослой рыбы-зерба ^4,10. Тем не менее, оба метода имеют ограничения при доставке токсичных соединений, таких как доксорубицин, что приводит к серьезному повреждению формы тела и гибели рыб. Побочные эффекты могут значительно усложнить интерпретацию данных. Несмотря на то, что эти проблемы могут быть решены с помощью интенсивного^{обучения10}, существует явная потребность в новом методе инъекции IP, который сводит к минимуму побочные эффекты.

Наша цель состоит в том, чтобы разработать новый метод инъекции IP, оптимизированный для эффективной доставки доксорубицина взрослым рыбкам данио, способствуя созданию надежных моделей кардиомиопатии (ДВС-синдрома), индуцированной доксорубицином, с минимальным повреждением организма и связанной с ним смертностью.

протокол

Все проводимые процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию клиники Майо в соответствии со стандартами, изложенными в «Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных» (National Academies Press, 2011). Все рыбки данио, участвовавшие в исследовании, относятся к штамму дикого индийского кариотипа (WIK). Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованном для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление и хранение стокового раствора доксорубицина

1. Получите запас доксорубицина из коммерческого источника.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Доксорубицин светочувствителен, поэтому приобретайте его в виде порошка и храните в непрозрачных контейнерах, чтобы защитить его от воздействия света. Выполните все этапы приготовления порошка Dox в химическом колпаке.
2. Полностью растворите порошок Dox в дистиллированной воде и приготовьте стоковый раствор с конечной концентрацией 5 мг/мл.
3. Аликвотируйте бульон, разделив его на пробирки объемом 1,5 мл.
4. Оберните трубки алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от воздействия света.
5. Хранить раствор аликвота Докс при температуре 4 °С при кратковременном хранении (<1 месяц), или при -20 °С при длительном хранении¹⁰.

2. Группировка рыб в соответствии с массой тела

1. Сгруппируйте рыбу с разницей в МТ менее 10% вместе для последующего впрыска.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить усилия на этом этапе, рыба с отклонением BW менее 10% относится к категории одного размера.
2. Дайте рыбе голодать в течение 24 часов перед инъекцией.
3. Обезболите рыб с помощью эмбриональной воды, содержащей 0,16 мг/мл трикаина, в течение 1 минуты.
4. Вытащите рыбу из воды с помощью трикаина и промокните обе стороны тела рыбы чистой фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю воду.
5. Измерьте и запишите МТ каждой рыбы, а затем немедленно верните рыбу в резервуар для восстановления, наполненный пресной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция докса проводилась рыбам после достижения 3-месячного возраста. В этом исследовании ученые использовали рыб в возрасте от 3 до 10 месяцев. МТ зрелых рыбок данио рерио штамма WIK может варьироваться от 0,2 г до 0,5 г. Длительная анестезия продолжительностью более 5 минут с последующей инъекцией Dox привела к высокой смертности рыбы.

3. Подготовка иглы и станция для инъекции

1. Определите объем ввода исходного раствора Dox (например, 5 мг/мл), необходимый для каждой рыбы, исходя из средней массы тела для достижения целевой дозы 20 г/г.
2. Используйте следующую формулу для расчета объема инъекции:
   
3. Добавьте 1x сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS) для разбавления раствора Dox, рассчитанного на шаге 1, для инъекций, достигнув общего объема 5 μл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объемный раствор для каждой группы рыб в зависимости от их МТ и включите еще 3 рыбы в каждую группу, чтобы гарантировать, что не будет недостатка в растворе для инъекций в ходе эксперимента.
4. Осторожно постучите по пробирке, а затем кратковременно проведите микроцентрифугу на максимальной скорости, чтобы собрать раствор при комнатной температуре в течение 10 секунд.
5. Поместите приготовленный раствор на лед и защитите его от воздействия света.
6. Поместите чистую чашку Петри диаметром 100 мм с губкой под препарирующий микроскоп, затем отрегулируйте фокус.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Губка содержит углубление длиной 4 см. Эластичное втягивание губки обеспечит рыбе поддержку и удержит тело рыбы в нужном положении. Губку можно использовать повторно.
7. Вооружите микрошприц объемом 10 мкл иглой со скошенной массой 34 G.
8. Промойте иглу 1x буфером HBSS, чтобы устранить любые пузырьки и удалить потенциальные закупорки из шприца.
9. Отмерьте 5 мкл раствора, приготовленного на шаге 4, для инъекции.

4. Процедура инъекции IP Dox

1. Поместите взрослую рыбу в воду с 0,16 мг/мл трикаина на 1 минуту, чтобы вызвать состояние потери сознания.
2. Расположите рыбу в углублении встроенной губки брюшком вверх (рисунок 1А).
3. Введите иглу под углом около 0°, начиная от средней точки грудного плавника по направлению к задней стороне сердечной полости (рис. 1В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте любого контакта с сердцем во время процедуры.
4. Направьте иглу к хвосту и пройдите под серебристую кожу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите иглу в непосредственной близости от серебряной кожи, стараясь не царапать или не прокалывать.
5. Следите за кончиком иглы в брюшной полости на протяжении всей операции (Рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения печени, кишечника, плавательного пузыря и других органов. Следите за тем, чтобы игла достигла конца кишечника, рядом с клоакальным отверстием.
6. Постепенно и равномерно дозируйте 5 мкл раствора Dox, затем медленно извлекайте иглу по исходной траектории, чтобы предотвратить утечку (Рисунок 1D).
7. Следите за брюшной полостью на наличие Dox, наблюдая за красной окраской раствора Dox (рисунок 1E).
8. Быстро переместите введенную рыбу в чистый резервуар, наполненный пресной водой, чтобы помочь рыбе восстановиться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Между инъекциями промойте иглу один раз 1x HBSS буфером.

5. Постинъекционное управление рыбой

1. Верните рыбу обратно в систему с циркуляцией после инъекции.
2. Заточите всю введенную рыбу еще на 24 часа, чтобы облегчить ее восстановление.
3. В течение первой недели внимательно следите за рыбой. Удалите умершую рыбу как можно скорее, чтобы не заразить других рыб.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смертельные случаи среди рыб в течение первых 24 часов вероятны из-за физических травм от инъекции или длительной анестезии. Записывайте количество рыб, чтобы построить кривую выживаемости.
4. Выполните эхокардиографию для фенотипирования рыб, получавших инъекцию Dox, через 56 дней после инъекции¹¹.
   Примечание: Обеспечьте единообразие условий и процедур для соответствующей контрольной группы, в которую вводится раствор HBSS.

Результаты

Ранее для введения доксорубицина^{взрослым рыбкам} данио ^4,10 применяли два внутрибрюшинных (ВП) метода. В методе I, также известном как классический метод инъекции IP, описанный Kinkel et ^al.4, игла вводилась под углом 45° к средней линии между брюшными п...

Обсуждение

В отличие от двух существующих способов внедрения IP ^4,10, новый способ внедрения IP характеризуется следующими отличительными особенностями. Во-первых, используется уникальный угол проникновения иглы (близкий к нулю); во-вторых, игла проникает в рыбу чер?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL NanoFil-syringe	World Precision Instruments, Inc	NANOFIL	injection tool
34 G needle	World Precision Instruments, Inc	NI34BV-2	injcetion tool
60 mm Petri dish	fisher scientific/fisherbrand	FB0875713A	placing the sponge
Dissecting microscope	Nikon	SMZ800	Injceting the Dox
Doxorubicin hydrochloride	Sigma	D1515-10MG	drug for creating DIC model
Echocardiography	VISUAL SONICS	Vevo 3100	measuring cardiac function
Foam Sponge	Jaece Industries	L800-D	placing the fish
Hank's balanced salt solution (HBBS)	Thermo Fisher	14025076	Vehicle for Dox
Microcentrifuge	southernlabware	MyFuge/C1012	collect the Dox solution
Precision Balance Scale	Torbal	AD60	Digital scales
Tricaine	Argent	MS-222	Anesthetizing fish
Tube	Eppendorf	1.5 mL	storage
vevo LAB  software	FUJIFILM VISUAL SONICS	5.6.0	quantification of the heart